[發(fā)明專利]一種芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選及降解活性的鑒定方法無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 200710011800.3 | 申請(qǐng)日： | 2007-06-20 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN101328467A | 公開(kāi)（公告）日： | 2008-12-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張曉黎;張惠文;蘇振成;李旭;張成剛 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所 |
| 主分類號(hào)： | C12N1/20 | 分類號(hào)： | C12N1/20;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 | 代理人： | 許宗富;周秀梅 |
| 地址： | 110016遼*** | 國(guó)省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 芐嘧磺隆 高效 降解 菌株 篩選 活性 鑒定 方法 | ||
1.一種芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：
1)降解菌的富集馴化：取8～10g接種源置入三角瓶中，加入80～100ml芐嘧磺隆濃度為50～100mg/L的富集培養(yǎng)基和5～10g玻璃珠，于28～30℃，150～180r/min搖床培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)5～7天，備用；將培養(yǎng)液按體積百分比5～10％的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的新的富集培養(yǎng)基中，于28～30℃，150～180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7天，而后將富集培養(yǎng)基中的芐嘧磺隆以50mg/L的濃度梯度遞增，按上述接種量和培養(yǎng)過(guò)程再轉(zhuǎn)接3～4次，得到富集菌液，待用；
2)分離篩選：在80～100ml芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的選擇性無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比5～10％的接種量接種步驟1)中的富集菌液，于28～30℃，180～200r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7天；而后將培養(yǎng)液按體積百分比5～10％的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的新的選擇性無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)過(guò)程再轉(zhuǎn)接3～4次，得到以芐嘧磺隆為唯一碳源的混合菌液，待用；
3)復(fù)壯、純化：將分離篩選所得的混合菌液，稀釋106～108倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，28～30℃培養(yǎng)2～3天，挑選不同性狀的單菌落在牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化；
4)驗(yàn)證降解菌：將步驟3)中純化好的菌株在選擇性無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上劃線，其中選擇性培養(yǎng)基內(nèi)添加芐嘧磺隆至終濃度為100～150mg/L，28～30℃培養(yǎng)3～4天，能夠生長(zhǎng)的菌株即為能夠以芐嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株；
5)鑒定降解菌株的降解活性：利用玉米生測(cè)法初篩出高活性的降解菌株，再利用高效液相色譜法確定高效菌株的降解率。
2.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于：所述步驟1)中的富集培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨8.0～10.0g，NaCl?0.8～1.0g，KH2PO40.8～1.0g，C6H12O61.0～2.0g，水1000ml，pH＝6.0～7.2。
3.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于：所述步驟2)和4)中的選擇性培養(yǎng)基的配方為：NH4NO30.5～1.0g，MgSO47H2O0.5～0.8g，(NH4)2SO40.5～0.8g，KH2PO40.5～0.8g，NaCl?0.5～0.8g，K2HPO42.0～2.5g，F(xiàn)eCl30.005～0.01g，CaCl20.01～0.02g，蒸餾水1000ml，pH＝6.0～7.2。
4.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于：所述步驟3)中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的組成為：牛肉膏2.5～5.0g，蛋白胨8.0～10.0g，NaCl?2.5～5.0g，瓊脂15.0～20.0g，水1000ml，pH＝7.0～7.2。
5.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于：所述采用芐嘧磺隆時(shí)用少量甲醇助溶，并在滅菌后加入培養(yǎng)基中。
6.一種按權(quán)利要求1所述的芐嘧磺隆高效降解菌株降解活性的鑒定方法，其特征在于：根據(jù)玉米生測(cè)實(shí)驗(yàn)主根長(zhǎng)抑制率y——芐嘧磺隆濃度對(duì)數(shù)x的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝ax+b，初步得出步驟4)中所得的以芐嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株的降解活性，篩選出高活性菌株，而后利用高效液相色譜得出高效菌株的精確降解率。
7.按權(quán)利要求6所述的鑒定方法，其特征在于：所述高效液相色譜的色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為：60～80∶20～40∶0～0.5；流速為0.6～1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230～260nm；柱溫為28～30℃；進(jìn)樣量為5～10μl。
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