[發(fā)明專(zhuān)利]一種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶及用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710011566.4
• 申請(qǐng)日: 2007-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101319207A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛百忠;薛雁;王宏英;徐梅;蘭海英;沈文彧;蘇珊;李英;高欣
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 沈陽(yáng)守正生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/50
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/50;C12N9/74;C12N1/19;C12N15/57;A61K38/48;A61P7/04
• 代理公司: 沈陽(yáng)晨創(chuàng)科技專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 張晨

1.一種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，能使含抗凝劑的動(dòng)物血漿凝固，其特征在于所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶的氨基酸序列相對(duì)于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys，具體為：

1???VIGGDECDIN??EHPFLAFMYY??SPRYFCGMTL??INQEWVLTAA

41??HCNRKFMRIH??LGKHAGSVAN??YDEVVRYPKE??KFICPNKKKN

81??VITDKDIMLI??RLDIPVKNSE??HIAPLSLPSN??PPSVGSVCRI

121?MGWGAITTSE??DTYPDVPHCA??NINLFNNTVC??REAYNGLPAK

161?TLCAGVLQGG??IDTCGGDSGG??PLICNGQFQG??ILSWGSDPCA

201?EPRKPAFYTK??VFDYLPWIQS??IIAGNKTATC??P。

2.按照權(quán)利要求1所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述具有生物活性的定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，通過(guò)將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌中，或者在CHO細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。

3.按照權(quán)利要求2所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述酵母菌為甲醇酵母菌。

4.按照權(quán)利要求3所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于：在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列。

5.按照權(quán)利要求4所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于：在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因插入到甲醇酵母菌表達(dá)載體pPIC9K或pPICZα中。?

6.按照權(quán)利要求4或5所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列為：

1???GTTATTGGTG?GTGATGAATG?TGATATTAAC?GAACATCCAT?TTTTGGCTTT

51??TATGTACTAC?TCTCCAAGAT?ACTTTTGTGG?TATGACTTTG?ATTAACCAAG

101?AATGGGTTTT?GACTGCTGCT?CATTGTAACA?GAAAGTTTAT?GAGAATTCAT

151?TTGGGTAAGC?ATGCTGGTTC?TGTTGCTAAC?TACGATGAAG?TTGTTAGATA

201?CCCAAAGGAA?AAGTTTATTT?GTCCAAACAA?GAAGAAGAAC?GTTATTACTG

251?ATAAGGATAT?TATGTTGATT?AGATTGGATA?GACCAGTTAA?GAACTCTGAA

301?CATATTGCTC?CATTGTCTTT?GCCATCTAAC?CCACCATCTG?TTGGTTCTGT

351?TTGTAGAATT?ATGGGTTGGG?GTGCTATTAC?TACTTCTGAA?GATACTTACC

401?CAGATGTTCC?ACATTGTGCT?AACATTAACT?TGTTTAACAA?CACTGTTTGT

451?AGAGAAGCTT?ACAACGGTTT?GCCAGCTAAG?ACTTTGTGTG?CTGGTGTTTT

501?GCAAGGTGGT?ATTGATACTT?GTGGTGGTGA?TTCTGGTGGT?CCATTGATTT

551?GTAACGGTCA?ATTTCAAGGT?ATTTTGTCTT?GGGGTTCTGA?TCCATGTGCT

601?GAACCAAGAA?AGCCAGCTTT?TTACACTAAG?GTTTTTGATT?ACTTGCCATG

651?GATTCAATCT?ATTATTGCTG?GTAACAAGAC?TGCTACTTGT?CCA。

7.按照權(quán)利要求3所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，利用酵母菌的α-信號(hào)肽，PHO1信號(hào)肽，或者利用巴曲酶的天然信號(hào)肽將巴曲酶移出細(xì)胞，其中在信號(hào)肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入KEX2蛋白酶識(shí)別序列。?