[發明專利]一種定點突變的基因工程巴曲酶及用途

有效

• 申請號: 200710011566.4
• 申請日: 2007-06-06
• 公開（公告）號: CN101319207A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 薛百忠;薛雁;王宏英;徐梅;蘭海英;沈文彧;蘇珊;李英;高欣
• 申請（專利權）人: 沈陽守正生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N9/74;C12N1/19;C12N15/57;A61K38/48;A61P7/04
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司
• 代理人: 張晨

技術領域：

本發明涉及一種基因重組方法制備定點突變的巴曲酶——Batroxobin。其關鍵是巴曲酶基因的定點改造、合成、克隆、表達及產物的發酵表達和分離純化制備。突變的巴曲酶既可以作為止血藥的主要成份，也可以直接用作止血藥物。

背景技術：

自1963年奧地利學者Von?Klobusitzky首次從巴西矛頭蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶(類凝血酶)，也就是所說的巴曲酶。至今已發現30多種蛇毒中含有類凝血酶組份，并有20多種先后得到分離和純化，它們都能作用于哺乳動物血漿中纖維蛋白原A鏈中的Arg¹⁶-Gly¹⁷間的肽鍵，釋放出纖維蛋白肽A，從而快速地將血液中的纖維蛋原轉變為纖維蛋白，這些纖維蛋白就能聚集成疏松的栓子來封閉傷口，實現快速止血的效果。同時，在體內它并不激活凝血因子XIII，由其水解產生的纖維蛋白凝塊的側鏈不能交聯，易被纖維蛋白溶酶降解，所以不會造成血液系統的栓塞。巴曲酶現已經被成功地開發成止血藥——進口的有立止血(Reptilase)，國產的有巴曲亭，在臨床上具有很好的止血效果。

成熟的巴曲酶分子是由231個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，

其氨基酸序列如下：

1??VIGGDECDIN??EHPFLAFMYY??SPRYFCGMTL??INQEWVLTAA

41?HCNRRFMRIH??LGKHAGSVAN??YDEVVRYPKE??KFICPNKKKN

81?VITDKDIMLI??RLDIPVKNSE??HIAPLSLPSN??PPSVGSVCRI

121?MGWGAITTSE??DTYPDVPHCA??NINLFNNTVC??REAYNGLPAK

161?TLCAGVLQGG??IDTCGGDSGG??PLICNGQFQG??ILSWGSDPCA

201?EPRKPAFYTK??VFDYLPWIQS??IIAGNKTATC??P

其DNA序列如下：

1???GTCATTGGAG?GTGATGAATG?TGACATAAAT?GAACATCCTT?TCCTTGCATT?CATGTACTAC

61??TCTCCCCGGT?ATTTCTGTGG?TATGACTTTG?ATCAACCAGG?AATGGGTGCT?GACCGCTGCA

121?CACTGTAACA?GGAGATTTAT?GCGCATACAC?CTTGGTAAAC?ATGCCGGAAG?TGTAGCAAAT

181?TATGATGAGG?TGGTAAGATA?CCCAAAGGAG?AAGTTCATTT?GTCCCAATAA?GAAAAAAAAT

241?GTCATAACGG?ACAAGGACAT?TATGTTGATC?AGGCTGGACA?GACCTGTCAA?AAACAGTGAA

301?CACATCGCGC?CTCTCAGCTT?GCCTTCCAAC?CCTCCCAGTG?TGGGCTCAGT?TTGCCGTATT

361?ATGGGATGGG?GCGCAATCAC?AACTTCTGAA?GACACTTATC?CCGATGTCCC?TCATTGTGCT

421?AACATTAACC?TGTTCAATAA?TACGGTGTGT?CGTGAAGCTT?ACAATGGGTT?GCCGGCGAAA

481?ACATTGTGTG?CAGGTGTCCT?GCAAGGAGGC?ATAGATACAT?GTGGGGGTGA?CTCTGGGGGA

541?CCCCTCATCT?GTAATGGACA?ATTCCAGGGC?ATTTTATCTT?GGGGAAGTGA?TCCCTGTGCC

601?GAACCGCGTA?AGCCTGCCTT?CTACACCAAG?GTCTTTGATT?ATCTTCCCTG?GATCCAGAGC

661?ATTATTGCAG?GAAATAAAAC?TGCGACTTGC?CCG