[發明專利]一種快速篩選具有吸附特性的多環芳烴降解菌的方法

無效

• 申請號: 200710010803.5
• 申請日: 2007-03-30
• 公開（公告）號: CN101050421A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 張穎;王榮;任瑞霞;徐慧;李慧;史榮久
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/26;B09C1/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 張志偉

技術領域

本發明涉及污染土壤的微生物修復技術領域，具體為一種利用吸附性載體篩選多環芳烴降解菌的新方法。

背景技術

多環芳烴是一大類環境有機污染物，具有致癌、致畸、致突變的作用，其中有16種被美國環保署列為優先污染物。消除多環芳烴的污染，對于改善環境、提高人民生活質量有很重要的意義。環境中的多環芳烴主要靠微生物降解，所以篩選高效降解菌是多環芳烴污染土壤生物修復技術的一個關鍵。目前，傳統的方法是采用液體搖瓶培養法篩選降解菌株。這種方法的主要缺點是僅篩選到在懸浮液體中快速生長的微生物類群，具有吸附能力的降解菌很難篩選到，而污染環境中污染物大都吸附在固體顆粒物上。

發明內容

本發明的目的是提供一種真實可靠、快速高效篩選多環芳烴降解菌的方法。

本發明的技術方案是：

一種快速篩選具有吸附特性的多環芳烴降解菌的方法，結合多環芳烴水溶性很低、極易吸附在顆粒物上的特性，利用吸附性載體富集多環芳烴降解菌，采用雙層平板法進行初篩，并用高效液相色譜技術測定其對多環芳烴的降解效率，最終篩選到高效降解菌。

1、污染土壤樣品的采取和預處理

采取0-20cm深度土壤樣品，過1mm篩，4℃保存。

2、利用吸附性載體富集及分離降解菌

在三角瓶內添加吸附性載體，其加入量以遮蓋住三角瓶底部為宜(10-20g)，用紗布包好，于121℃，濕熱滅菌20分鐘。將1mg/mL的多環芳烴丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發，最后加入40mL無機鹽培養基和10mL土壤懸液，30℃避光搖床培養。每10天取3～4g載體轉接到新鮮配制的含載體的無機鹽液體培養基中。30天后將載體取出，用無菌水沖洗掉土壤顆粒和非吸附的菌體，置于以多環芳烴為唯一碳源的含制霉菌素的無機鹽固體培養基平板上，30℃培養4～6天。將載體周圍菌苔刮下，在上述平板上劃線分離單菌落，斜面保存。其中，

吸附性載體可以為改善土壤質地常用的珍珠巖、稻殼等。

土壤懸液的制備如下：稱土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠的用量以充滿瓶底為最好)，振蕩5～10分鐘，使土樣充分打散，即成為10^-2的土壤懸液。

無機鹽液體培養基的組成如下：K₂HPO₄?1g；KH₂PO₄?1g；NaCl?0.5g；NH₄Cl?1g；MgSO₄·7H₂O?0.2g；CaCl₂?15mg；FeSO₄·7H₂O?2mg；CuSO₄·5H₂O0.4mg；KI?1mg；MnSO₄·H₂O?4mg；H₃BO₃?5mg；CoCl₂·6H₂O?1mg；Na₂MoO₄·2H₂O?2mg；NiCl₂·6H₂O?2mg，溶于1L蒸餾水中；pH?7.0±0.2；

含載體的無機鹽液體培養基的具體組成如下：在三角瓶內先添加吸附性載體，其加入量以遮蓋住三角瓶底部為宜(10-20g)，用紗布包好121℃濕熱滅菌20分鐘；待其冷卻后，將1mg/mL的多環芳烴丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發，然后加入50mL無機鹽液體培養基。