[發(fā)明專利]一種檢測土壤硝酸還原酶活性的分析方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710010680.5
• 申請(qǐng)日: 2007-03-21
• 公開（公告）號(hào): CN101271060A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武志杰;雋英華;陳利軍;史云峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
• 主分類號(hào): G01N21/31
• 分類號(hào): G01N21/31;G01N1/28;C12Q1/26
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 馬馳;周秀梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及土壤中硝酸還原酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中硝酸還原酶活性的分析方法。

背景技術(shù)

土壤中的硝酸還原酶能將土壤氮代謝過程中形成的硝態(tài)氮還原生成亞硝態(tài)氮，土壤中的還原態(tài)化合物可作為氫的供體。

因此，土壤中硝酸還原酶活性的強(qiáng)弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氣態(tài)損失，間接影響氮肥的利用效率和大氣的氮污染。土壤中硝酸還原酶的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質(zhì)地的強(qiáng)烈影響，同時(shí)也受到農(nóng)田耕作制度、管理措施以及不同種植作物的影響。因此，對(duì)土壤中硝酸還原酶活性的檢驗(yàn)有很重要的意義。而到目前為止，有關(guān)硝酸還原酶活性的測定基本都是參照Φ.X.哈茲耶夫[蘇]著，鄭洪元、周禮愷、張德生譯的《土壤酶活性》和Kandeler(1995)的《Methodsin?soil?biology》等書中的方法。該種方法步驟比較繁瑣，需用專用的試劑瓶和抽濾裝置進(jìn)行抽真空培養(yǎng)，且培養(yǎng)批次的不同具有差異性和不確定性，使其難以適應(yīng)土壤中硝酸還原酶活性的定性比較和定量研究；同時(shí)，該種方法樣品的前期處理比較麻煩，降低了實(shí)驗(yàn)的效率，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢驗(yàn)土壤中硝酸還原酶活性的分析方法。該方法是在借鑒前人測定方法的原理基礎(chǔ)上，對(duì)硝酸還原酶活性的測定步驟和顯色方法進(jìn)行了部分改進(jìn)(對(duì)其樣品的處理方法和測定方法進(jìn)行改進(jìn))，從而減少樣品處理和試驗(yàn)步驟的復(fù)雜性，使分析結(jié)果更加精確可靠，分析重現(xiàn)性更好。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種檢測土壤中硝酸還原酶活性的分析方法，

1)稱取0.5-1g過0.5-1.5mm篩的土壤風(fēng)干樣品n份分別裝入n支試管中，n≥2，向試管中分別加入1-3mL?0.5-1mM/L的2，4-二硝基酚溶液，混勻；然后向其中n-1支試管中加入1-1.5mL重量濃度0.05-0.15％的底物KNO₃溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對(duì)照；再向試管中分別加入1-2mL重量濃度0.5％-1％的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補(bǔ)充至5-10mL，搖勻，塞上不透氣的橡膠塞后29-31℃恒溫培養(yǎng)24h；同時(shí)作試劑空白對(duì)照(不加土壤，其余同樣品處理)；

2)培養(yǎng)結(jié)束后，用10-40mL蒸餾水將試管內(nèi)的土液混合物完全轉(zhuǎn)移至100mL的三角瓶中，再用蒸餾水補(bǔ)充至50-100mL；

3)加入鋁鉀礬飽和溶液1-2mL，振蕩，過濾；

4)取濾液1mL于50mL容量瓶中，加入1-3mL蒸餾水和4-8mL顯色劑(相對(duì)于亞硝酸根離子過量)，然后用蒸餾水定容至刻度。15分鐘后，在520nm下用分光光度計(jì)比色測定吸光值A(chǔ)；

5)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備：吸取亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，定容至100mL，此為2.5mgNO₂^--N/L的溶液。再分別吸取該液0、1、2、3、4、5mL于50mL容量瓶中，加少量蒸餾水和4mL顯色劑，并用蒸餾水定容。此標(biāo)準(zhǔn)系列含亞硝態(tài)氮的量分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mgNO₂^--N/L。在520nm下比色測定一系列已知濃度的NO₂^--N標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值A(chǔ)’，以NO₂^--N溶液的濃度和吸光值A(chǔ)’制作工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率b；

6)根據(jù)吸光值A(chǔ)和斜率b，計(jì)算所測定溶液中亞硝酸根的濃度S，S＝A*b；

7)計(jì)算樣品中亞硝酸根含量；

8)計(jì)算硝酸還原酶活性：

計(jì)算公式為：[(S₁-S₂)*50*V₁/1000*V₂]/W.T＝mgNO₂-N/g土.24h

式中：S₁為樣品中的NO₂-N的含量(mg/L)；S₂為樣品對(duì)照中的NO₂-N的含量(mg/L)；50為定容的溶液體積(mL)；V₁為提取液總體積(mL)；V₂為吸取濾液的體積(mL)；W為稱土樣重(g)；T為培養(yǎng)土樣的時(shí)間(h)；1000為單位轉(zhuǎn)化系數(shù)。