[發明專利]一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法

無效

• 申請號: 200710009155.1
• 申請日: 2007-06-26
• 公開（公告）號: CN101081298A
• 公開（公告）日: 2007-12-05
• 發明（設計）人: 陳少鶯;程曉霞;俞伏松;陳仕龍;林天龍;林梅
• 申請（專利權）人: 陳少鶯
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法。

背景技術

偽狂犬病是多種動物共患性傳染病，豬是其自然宿主，感染豬康復后呈隱性感染，主要引起妊娠母豬流產、死胎或木乃伊，初生仔豬出現神經癥狀、麻痹、衰竭直至死亡，死亡率幾乎100％，斷奶仔豬發病率為20％-40％，死亡率為10％-20％，該病已成為目前種豬繁殖障礙綜合癥的主要病因，并明顯呈逐年上升趨勢。由于成年豬多為隱性感染，并長期帶毒和排毒而成為潛在的傳染源，給該病的控制和消滅帶來極大的困難。目前世界各國對PR的有效預防主要是疫苗免疫接種，現有的豬偽狂犬病疫苗有油乳劑滅活疫苗及傳統的弱毒疫苗和基因缺失疫苗，這些疫苗的不足之處在于：如油乳劑滅活疫苗安全性好，但免疫效果不理想，注射局部副作用大，血清學檢測不能區分疫苗免疫抗體和強毒抗體；弱毒疫苗免疫效果良好，但不能區分疫苗免疫抗體和強毒抗體，且存在毒力返強的危險；基因缺失弱毒疫苗免疫效果良好，并能區分疫苗免疫抗體和強毒抗體，但基因缺失苗可能會因基因重組變為強毒株等潛在的不安全問題。因此，改進現有的疫苗成為各國研究人員攻克的難題，國外已開展了豬偽狂犬病亞單位ISCOM疫苗的研究，其不足之處在于：以強毒為制苗種毒，疫苗制備復雜繁瑣，疫苗的保存期不明確，限制了疫苗的規模化生產和臨床應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法，本發明以偽狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)為種毒，提取PRV-FB囊膜蛋白為免疫原，應用新型佐劑QuilA和離心透析相結合的免疫刺激復合物制苗新技術，研制成安全有效的豬偽狂犬病新型亞單位疫苗，研制出的疫苗可用于豬偽狂犬病的預防和控制，并為動物病毒性重大疫病的新型疫苗研究開拓一條新途徑。

本發明所述的疫苗的制備方法是：將PRV-FB株細胞毒經差速離心后，重懸于PBS中，調整病毒抗原的蛋白濃度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以離心方法提取囊膜蛋白，加入適當的ISCOM基質，裝袋透析即為PRV新型亞單位疫苗。

本發明是以偽狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)為種毒，提取PRV-FB囊膜蛋白為免疫原，應用免疫刺激復合物(ISCOM)制苗新技術，研制成安全有效的豬偽狂犬病新型亞單位疫苗，可用于豬偽狂犬病的預防和控制；本發明首次在國內外全面系統測定了該疫苗的生物學特性、疫苗的安全性、免疫原性、保存期、抗體持續期、攻毒保護率和最小免疫量等各項免疫學指標。該疫苗主要含囊膜糖蛋白不含核酸，不存在疫苗毒的潛伏感染問題，安全性好；同時，優化了囊膜提取技術，簡化了生產工藝，ISCOM的應用解決了亞單位疫苗免疫原性差的難題。

附圖說明

圖1是PRV囊膜蛋白免疫刺激復合物電鏡照片(×10萬)復印件。

具體實施方式

以下通過試驗例來進一步說明本發明及本發明的有益效果，(但不是對本發明的限制)。

本發明所述的疫苗制備方法是：將PRV-FB株細胞毒經差速離心后，重懸于PBS中，調整病毒抗原的蛋白濃度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以離心方法提取囊膜蛋白，加入適當的ISCOM基質，裝袋透析即為PRV新型亞單位疫苗。

PRV囊膜蛋白亞單位疫苗不含核酸成份，安全性好，且血清學方法能將自然感染動物和疫苗接種動物區別開，但免疫原性差。為此，本發明人進一步采取如下措施，提高其免疫效果：

(1)上述PRV-FB弱毒的特征與培養是：偽狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)是經乳兔腎原代細胞連續傳180代結合蝕斑克隆和低溫誘變技術選育出的弱毒株，PRV-FB株對豬、牛、羊等家畜已無致病性；對易感家兔和乳豬盲傳五代，無返強現象；接種動物同居接觸感染末發現水平傳播。上述PRV-FB弱毒株能在如CEF、MDEF、PK-15、VERO、RK、Marc-145等多種細胞上生長，本發明考慮到產業化生產的需要，上述PRV-FB弱毒株選用CEF或Marc-145細胞為病毒培養細胞；PRV-FB病毒的培養是將PRV-FB株種毒接種CEF或Marc-145單層細胞，接種量為培養液量的1％，37℃旋轉培養至細胞病變達80％時，收獲細胞毒。

(2)上述病毒抗原的制備為：將PRV-FB細胞毒經-20℃凍融3次，5000rpm離心30-60mins，取上清35000rpm離心90-120mins，取沉淀重懸于PBS中，調整病毒抗原的蛋白濃度為10-12mg/ml，即為制苗用病毒抗原。