[發明專利]一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法

無效

• 申請號: 200710009155.1
• 申請日: 2007-06-26
• 公開（公告）號: CN101081298A
• 公開（公告）日: 2007-12-05
• 發明（設計）人: 陳少鶯;程曉霞;俞伏松;陳仕龍;林天龍;林梅
• 申請（專利權）人: 陳少鶯
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法，其特征在于所述的疫苗制備方法是：將PRV-FB株細胞毒經差速離心后，病毒重懸于PBS中，調整病毒抗原的蛋白濃度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以離心方法提取囊膜蛋白，加適當的ISCOM基質，裝袋透析即為PRV新型亞單位疫苗。

2、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述PRV-FB株的特征與培養是：PRV-FB株是經乳兔腎原代細胞連續傳180代結合蝕斑克隆和低溫誘變技術選育出的弱毒株，PRV-FB株對豬、牛、羊等家畜已無致病性，對易感家兔和乳豬盲傳五代，無返強現象，接種動物同居接觸感染末發現水平傳播；PRV-FB弱毒株能在CEF、MDEF、PK-15、VERO、RK、Marc-145多種細胞上生長，所述PRV-FB株選用CEF或Marc-145細胞為病毒培養細胞；PRV-FB病毒的培養是將PRV-FB株種毒接種CEF或Marc-145單層細胞，接種量為培養液量的1％，37℃旋轉培養至細胞病變達80％時，收獲細胞毒。

3、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述病毒抗原的制備為：將PRV-FB細胞毒經-20℃凍融3次，5000rpm離心30-60mins，取上清35000rpm離心90-120mins，取沉淀重懸于PBS中，調整病毒抗原的蛋白濃度為10-12mg/ml，即為制苗用病毒抗原。

4、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的Mega-10作用時間和濃度確定是：用0.01M?pH7.2PBS將上述病毒抗原稀釋至蛋白濃度為10mg/ml，在制苗用病毒抗原中加入Mega-10至終濃度為1％～2％，分別于37℃、室溫下作用2～5小時，將病毒液鋪到蔗糖墊上，蔗糖墊的上層為PBS配制的10％蔗糖，下層為30％蔗糖，超速離心機、RP40轉頭、35000rpm、20℃離心90-120mins，收集樣品層和10％蔗糖層，裝透析袋對0.01M?pH7.2PBS透析48小時，收獲約3ml即為PRV囊膜蛋白，各取20ul按Bradford法置DyNA?Quant200測定儀測定蛋白濃度；Mega-10對PRV囊膜蛋白的最適作用濃度為2％，作用時間最佳為在37℃條件下3小時，其次為室溫條件下4小時。

5、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的ISCOM基質及QuA濃度的選擇是：將收集的囊膜蛋白樣品層和10％蔗糖層混合后分成A、B、C三組，分別加入含0.05％、0.1％、0.2％Quil?A的ISCOM基質，對PBS透析48hrs并經適當濃縮后，取少許電鏡檢查混合物中的ISCOM顆粒，同時各免疫5只10--12周齡昆明系小白鼠，測定血清抗體；通過電鏡觀察和抗體水平測定比較ISCOM基質中各成份Quil?A、卵磷脂、膽固醇不同含量的效果，篩選出較佳組合中的QuilA適宜濃度為0.1％。

6、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的制備方法的新型疫苗的聚丙烯酰胺凝膠電泳譜SDS-PAGE是：PRV新型疫苗主要蛋白帶4條，分子量約為63、50、34、26.5KD。

7、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的新型疫苗的Westernblot特征是：新型疫苗免疫鼠血清能識別PRV的部分蛋白帶，分子量約為63、50KD，而鼠抗PRV強毒血清識別的蛋白條帶分子量約為95.5、86、63、34KD。