[發(fā)明專利]抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710009084.5
• 申請日: 2007-06-08
• 公開（公告）號: CN101096385A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周克夫;李俊燕
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/09;C12N1/21;A61K38/16;A61P3/10
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法，其特征在于其包括以下步驟：

1)根據(jù)ProTα的基因序列，設(shè)計上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分別為：

上游引物P1：5’GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，

下游引物P2：5’GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，

將上游引物P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoRI酶切位點(diǎn)；

2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-TVector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽性菌液測序；

3)采用生物學(xué)軟件DNAman對7個單克隆基因序列和參考的proTα的基因序列進(jìn)行比對；

4)用EcoRI和BamHI雙酶切ProTαPCR產(chǎn)物，將ProTα基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX?6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得轉(zhuǎn)基因BL21菌株，在LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，加入IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得融合蛋白。

2.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得轉(zhuǎn)基因BL21菌株可經(jīng)過超聲破碎后離心，得上清，將上清經(jīng)過GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Proα融合蛋白。

3.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述的在LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)在培養(yǎng)至OD_500nm為0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)的時間為5h，菌液離心后的沉淀用等體積的上樣緩沖液溶解，沸水浴中10min后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

4.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。

5.如權(quán)利要求1所述的抗氧化及預(yù)防糖尿病發(fā)生的融合蛋白在制備預(yù)防糖尿病藥物中的應(yīng)用。