[發明專利]克列維醇的制備方法及在制抗乙酰膽堿酯酶藥物的應用

無效

• 申請號: 200710008928.4
• 申請日: 2007-04-29
• 公開（公告）號: CN101070550A
• 公開（公告）日: 2007-11-14
• 發明（設計）人: 鄭忠輝;黃珊珊;杜希萍;黃耀堅;宋思揚;沈月毛
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12P7/26
• 分類號: C12P7/26;A61K31/122;A61P25/28;C12R1/66
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所
• 代理人: 馬應森

1.克列維醇的制備方法，所述的克列維醇來源于紅樹林內生真菌次級代謝產物，紅樹林內生真菌為矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus?clavatonanicus?BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?NO：M206063，所述的克列維醇為2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化學結構式如下：

其特征在于包括以下步驟：

1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus?clavatonanicus?BYY-1)的種子培養

A.配制斜面培養基：馬鈴薯去皮切塊，放入海水中，煮后過濾，濾液用海水定容，得馬鈴薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及瓊脂，分裝試管，滅菌后制成斜面培養基，將矮棒曲霉BYY-1轉接至斜面培養基上培養；

B.配制種子液：在馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分裝后滅菌，得種子培養基，將培養的斜面菌種接入到分裝后的種子培養基中，搖瓶培養，得種子液；

C.種子罐種子培養：先配制種子培養基，將種子培養基裝入種子罐，將培養的種子液接入種子罐中，培養后得培養后的種子液，所述種子培養基的配方與B中的種子培養基相同；

2)克列維醇的發酵

配制發酵培養基，將發酵培養基裝入發酵罐，將培養后的種子液接入發酵罐中，發酵后得發酵液，所述發酵培養基的配方與步驟1)B和C中的種子培養基相同；

3)克列維醇的提取

將發酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮后用有機溶劑萃取，收集有機相并減壓濃縮成浸膏；

4)克列維醇的精制

浸膏用甲醇溶解得克列維醇甲醇溶液，在克列維醇甲醇溶液中加入硅膠拌樣，上硅膠柱進行分離，以石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫，收集當石油醚/乙酸乙酯的體積比例為50～3∶1時的洗脫液，合并洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加溶劑溶解后重結晶至少2次，得目標產物，即克列維醇，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100。

2.如權利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，配制斜面培養基的馬鈴薯去皮切成小塊，取150～300g放入1L?20％～100％海水中，煮后過濾，濾液用20％～100％海水定容至1000ml，得馬鈴薯汁。

3.如權利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，添加葡萄糖或蔗糖的量為10～30g，瓊脂1.5～3.0g，分裝試管，121℃滅菌30min后制成斜面培養基，將矮棒曲霉BYY-1轉接至斜面培養基上后25～32℃下培養3～7d。

4.如權利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，配制種子液時，在每升馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分裝后121℃滅菌30min，得種子培養基，將培養的斜面菌種接入到分裝后的種子培養基中，25～32℃下，120～250r/min搖瓶培養2～5d，得種子液。

5.如權利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，種子罐種子培養時，將種子培養基裝入種子罐的裝罐量為種子罐容積的60％～70％，將培養的種子液按接種量2％～10％接入種子罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉速120～220r/min和通氣量0.3～1.2vvm的條件下培養2～4d，得培養后的種子液。

6.如權利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟2)中，配制發酵培養基時，將發酵培養基裝入發酵罐的裝罐量為發酵罐容積的60％～70％，將培養后的種子液按接種量5％～10％接入發酵罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉速120～200r/min和通氣量0.3～1.5vvm的條件下發酵4～7d，得發酵液。

7.如權利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟3)中，將發酵液過濾除菌體，濾液減壓濃縮至發酵液體積的35％～20％后用有機溶劑萃取至少2次，收集有機相并減壓濃縮成浸膏。

8.如權利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟3)中，有機溶劑選自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一種。