[發(fā)明專利]多種對蝦病毒同步檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710008825.8
• 申請日: 2007-04-10
• 公開（公告）號: CN101285103A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐麗美
• 申請（專利權(quán)）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張松亭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及五種對蝦病毒，即對蝦白斑綜合癥病毒(White?SpotSyndrome?Virus，WSSV)、斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Monodon?Baculovirus，MBV)、對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious?Hypodermal?andHematopoietic?Necrosis?Virus?IHHNV)、對蝦肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic?Parvovirus，HPV)、對蝦托拉病毒(Taura?S?yndromeVirus，TSV)的快速檢測方法，適用于對蝦、對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的其它水生動物及其對蝦餌料生物的檢疫和檢測，屬于對蝦養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來，隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，一些毒力強、宿主范圍廣的對蝦病毒也相繼出現(xiàn)，如對蝦白斑綜合癥病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、對蝦托拉病毒等，這些病毒均為養(yǎng)殖及野生對蝦的主要病原，都曾引起養(yǎng)殖對蝦大面積死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失。對于病毒性疾病迄今為此沒有有效的治療方法，因此借助早期診斷技術(shù)、及早預(yù)防，將有利于防止病毒的發(fā)生及傳播。

對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是一種沒有包涵體的新型桿狀病毒，每年造成對蝦大量死亡，給生產(chǎn)帶來巨大損失，是迄今為止危害最為嚴重的一種對蝦病毒。與WSSV同為斑節(jié)對蝦主要病原的斑節(jié)對蝦桿狀病毒是一種有包涵體的雙鏈環(huán)狀的DNA病毒，受染對蝦生長明顯滯緩，單獨感染時對蝦致死率為70％左右，然而MBV與其它病原如弧菌或其它病毒的混合感染致死率在90％以上。另外，對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)和對蝦肝胰腺細小病毒(HPV)均歸屬于細小病毒科。與其它某些病毒相比IHHNV雖然毒力不是很強，但易在宿主體內(nèi)造成隱性感染，或與其它毒力強的病毒混合感染，加重對蝦病害的發(fā)生；另一方面許多對蝦品種對這一病毒具有耐受性而成為隱性攜帶者，這樣使得病毒由親代向子代垂直傳播以及通過苗種交流向其它群體擴散的機率增大，還可以引起對蝦出現(xiàn)慢性“矮小殘缺綜合癥”，導(dǎo)致患病對蝦生長緩慢，表皮畸形；HPV也是對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害較為嚴重的對蝦病毒之一，其侵染的靶細胞為對蝦肝胰腺和中腸后段上皮細胞。對蝦托拉病毒(TSV)為小RNA病毒科，主要感染西半球的對蝦品種，其中以太平洋白對蝦最為敏感，對蝦感染病毒后死亡率高達40-95％，曾引起美洲對蝦養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失。因此對以上五種病毒的檢測成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中的重要課題。目前，已經(jīng)有多種方法可以用來檢測對蝦病毒，包括實時定量PCR、原位雜交、ELISA、多重PCR和核酸探針斑點雜交等。國外學(xué)者Dhar等建立的實時定量SYBR?GreenPCR檢測WSSV獲得滿意結(jié)果。該方法對WSSV最低檢出限為1個拷貝，敏感度是常規(guī)PC?R的20-100倍。雖然實時定量PCR是目前最先進的檢測技術(shù)之一，但是它必須配備價格昂貴的儀器設(shè)備且實驗人員要經(jīng)過特定培訓(xùn)，這些缺點都限制了它的推廣使用。在利用PCR檢測病毒方面，國內(nèi)學(xué)者在《病毒學(xué)報》(2005，21(5)：393-396)上發(fā)表了同時檢測TSV，IHHNV和WSSV的多重RT-PCR技術(shù)。對同一樣品中的TSV?RNA，IHHNV?DNA和WSSV?DNA模板擴增可得到3條大小與實驗設(shè)計相符的231bp(TSV)，593bp(WSSV)和356bp(IHHNV)的特異性擴增帶。該技術(shù)最低能檢測至10pg?TSV?RNA，100pg?IHHNV?DNA和100pg?WSSV?DNA。從國內(nèi)發(fā)表的文章可以看出，涉及到TSV和其它病毒同時檢測的實驗都要分別制備病毒RNA和DNA模板，而RNA的提取往往較復(fù)雜且易被降解從而影響到實驗結(jié)果，所以該方法也對實驗人員有較高的要求而不利于推廣。最近報道的檢測WSSV的核酸探針點雜交方法(高技術(shù)通訊，2004，14(3)：33-361)，雖吸取了的高度敏感和探針高度特異等優(yōu)點，但還存在著操作更為復(fù)雜，檢測時間更長和不能定量的缺點。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明推出了能方便、快速、準確檢測WSSV、MBV、IHHNV、HPV和TSV的方法，以期為對蝦病原的檢測提供科學(xué)依據(jù)。其最大的優(yōu)點在于五種病毒PCR模板的制備采用同一個方法，即在同一個樣品中提取到的RNA和DNA可同時用于以上五種病毒的檢測。本發(fā)明不采用多重PCR，避免了因PCR對不同片段擴增效率不同而造成的偏向性，而是對五種病毒同時進行平行檢測，不僅達到了多重PCR的效果，還真實的反映了樣品中各種病毒的含量。此外，本發(fā)明采用了二溫式PCR法大大縮短了檢測的時間；同時提高了PCR檢測的特異性。