[發(fā)明專利]多種對蝦病毒同步檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710008825.8
• 申請日: 2007-04-10
• 公開（公告）號: CN101285103A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐麗美
• 申請（專利權(quán)）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張松亭

1.一種多種對蝦病毒同步檢測方法，其利用PCR技術(shù)檢測WSSV、MBV、IHHNV、HPV、TSV五種對蝦病毒，

(1).依據(jù)WSSV、MBV、IHHNV、HPV、TSV的核酸保守序列設(shè)計了特異性強的引物序列；

(2).建立從對蝦組織中制備PCR模板的通用方法，所制備的樣品能作為檢測各種病毒的模板；

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用PCR技術(shù)檢測WSSV、MBV、IHHNV、HPV、TSV五種對蝦病毒的方法，其特征在于所有病毒檢測的PCR擴增條件一致，能在一臺熱循環(huán)儀上同時檢測多種病毒。

3、根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多種對蝦病毒同步檢測方法，其特征在于設(shè)計的PCR引物為：

用于檢測WSSV引物為：

C45’TCA?CAG?GCG?TAT?TGT?CTC?TCC?T??3’

N45’CAC?GAG?TCT?ACC?GTC?ACA?ACA?TC??3’

預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物為298bp；

用于檢測MBV引物為：

MBV-15′TCC?AAT?CGC?GTC?TGC?GAT?ACT??3′

MBV-25′CGC?TAA?TGG?GGC?ACA?AGT?CTC??3

預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物為361bp；

用于檢測IHHNV引物為：

IV-1：5′GAC?CGG?ACG?AAA?TGG?ACG??3′

IV-2：5′TCG?CTT?CAG?CTT?CGG?CTC??3′

預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物為264bp；

用于檢測HPV引物為：

HPV-f：5′AGA?ACG?CAT?AGA?AAA?CGC?TAA?GA??3′

HPV-r：5′TGC?GGT?GGC?GCT?GGA?ATG??3′

預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物為254bp；

用于檢測TSV引物為：

T07：5′TCA?ATG?AGA?GCT?TGG?TCC?TGG?3′

T08：5′GCT?TGC?GTG?GTG?GGA?CTT?A??3′

預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物為220bp。

4、根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的多種對蝦病毒同步檢測方法，其特征在于PCR模板制備方法為：利用強變性劑異硫氰酸胍的強變性作用，并輔以去污劑十二烷基肌氨酸鈉來解聚蝦體中組織細胞和病毒的蛋白，使模板DNA從蝦體組織中釋放出來，再用玻璃粉即Silica吸附釋放的DNA或RNA片段；變性劑處理及后續(xù)的洗滌純化過程可以有效去除蝦體中存在的蛋白質(zhì)、多糖等妨礙PCR擴增的抑制因子，使PCR擴增反應(yīng)能夠很好地進行。

5、據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2或權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的多種對蝦病毒同步檢測方法，其特征在于PCR擴增反應(yīng)條件完全一致，實現(xiàn)每個樣品能同時在一臺PCR儀上進行不同病毒的檢測；PCR反應(yīng)條件為：95℃加熱變性2min，而后進行40個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)反應(yīng)包括94℃?30sec，68℃?60sec，循環(huán)完成后，68℃充分延伸2min。