[發(fā)明專利]同時(shí)對(duì)乙肝病毒基因型定型和定量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710001880.4
• 申請(qǐng)日: 2003-11-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101187632A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳培哲;陳定信;葉秀慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普生股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;C12P19/34;C12Q1/68;C12Q1/70;C07H21/04
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 陶家蓉

本申請(qǐng)是2003.11.25提交的申請(qǐng)?zhí)枮?00310119924.5，名為同時(shí)對(duì)乙肝病毒基因型定型和定量的方法的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一新穎的引物對(duì)、探針對(duì)和用乙肝病毒基因?yàn)槟０嫠鶖U(kuò)增而得的核酸，和用其同時(shí)對(duì)基因型作定型及定量乙肝病毒的方法。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphisms，SNPs)，即基因序列位置上一群變異的單核苷酸，其分布于整個(gè)基因序列中。單核苷酸多態(tài)性也可以是等位基因。也就是說(shuō)，由于存在該基因多態(tài)性，因此一物種中某些個(gè)體具有非變異序列(野生型)，而另一些個(gè)體則具有變異序列(變異型)。就動(dòng)物個(gè)體而言，基因多態(tài)性可能導(dǎo)致隱性遺傳疾病。上述疾病包括：牛淋巴球粘著缺乏癥(Bovine?LeukocyteAdhesion?Deficiency)、瓜胺酸血癥(Citrullinemia)、楓糖尿病(Maple?SyrupUrine?Disease)、尿苷單磷酸合成酶缺乏癥(Deficiency?of?Uridine?MonophosphateSynthase)、α-甘露糖苷貯積癥、泛發(fā)性糖原貯積癥等。人類的囊性纖維化(cysticfibrosis)是上述隱性遺傳疾病之一，該病患者群約占白種人族群中兩千分之一。就諸如細(xì)菌或病毒之類的微生物病原體而言，單核苷酸多態(tài)性與不同的致病效應(yīng)有關(guān)，并因此影響該病癥的病人的治療及長(zhǎng)期預(yù)后狀況。依據(jù)上述，迫切需要一種能夠有效鑒定及定量?jī)?nèi)含單核苷酸多態(tài)性的核酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及新穎的引物對(duì)、探針對(duì)和以乙肝病毒基因?yàn)槟０嫠鶖U(kuò)增而得到的核酸，和將其同時(shí)用于基因型定型及乙肝病毒定量上的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及一種能夠同時(shí)鑒定一微生物目標(biāo)核酸的單核苷酸多態(tài)性和定量該目標(biāo)核酸的方法。該鑒定和定量是同時(shí)執(zhí)行的。

本發(fā)明方法需使用第一探針及第二探針。該第一探針是與一目的核酸的第一序列相同或互補(bǔ)的，其包含與單核苷酸多態(tài)性相對(duì)應(yīng)的堿基；該第二探針與一目的核酸的第二序列相同或互補(bǔ)，其不包含與單核苷酸多態(tài)性相對(duì)應(yīng)的堿基。該第一探針共價(jià)結(jié)合于第一熒光標(biāo)記，該第二探針共價(jià)結(jié)合于第二熒光標(biāo)記。該第一熒光標(biāo)記及該第二熒光標(biāo)記中之一為熒光團(tuán)供體，另一為熒光團(tuán)受體，如此一來(lái)，當(dāng)該第一探針及第二探針與該目的核酸雜交時(shí)，該熒光團(tuán)供體與該熒光團(tuán)受體處于鄰近位置，使得兩者之間能夠進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。

本發(fā)明方法包括將一樣本中的目的核酸復(fù)制擴(kuò)增的步驟，其是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以一對(duì)引物(primer)序列進(jìn)行的，使得樣本中該目的核酸形成一包含該第一序列及該第二序列的雙鏈核酸。上述第一探針及第二探針在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火(annealing)步驟中與該核酸產(chǎn)物雜交，以分別形成第一雙鏈(duplex)及第二雙鏈。上述兩種探針可以雜交于該核酸產(chǎn)物的同一鏈上。上述兩種探針亦可以雜交于該核酸產(chǎn)物的不同鏈上，并且使得該熒光團(tuán)供體與該熒光團(tuán)受體位于鄰近位置上。例如該兩種探針?biāo)s交的序列可以位于該核酸產(chǎn)物雙鏈所形成的叉狀結(jié)構(gòu)或泡狀結(jié)構(gòu)上。

樣本中目的核酸的定量檢測(cè)，是通過(guò)測(cè)量該第一探針上熒光團(tuán)受體所發(fā)出的熒光量進(jìn)行的，其是在每一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)的退火期的最末階段進(jìn)行的。上述熒光量的測(cè)定是將該待測(cè)熒光強(qiáng)度與一預(yù)定值比較得知，其中該預(yù)定值是由含有已知濃度的該目的核酸的溶液測(cè)量而得。上述熒光量的測(cè)定亦可將該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的交叉值(cross?point?value，Cp?value)與一預(yù)定值比較得知，其中該預(yù)定值是由含有已知濃度的該目的核酸的溶液測(cè)量而得，其測(cè)量方法如Mackay?I.等，Nucleic?Acids?Res.30：1292-1305，2002所述。