[發明專利]同時對乙肝病毒基因型定型和定量的方法

無效

• 申請號: 200710001880.4
• 申請日: 2003-11-25
• 公開（公告）號: CN101187632A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發明（設計）人: 陳培哲;陳定信;葉秀慧
• 申請（專利權）人: 普生股份有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12P19/34;C12Q1/68;C12Q1/70;C07H21/04
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 陶家蓉

1.一種可同時鑒定乙肝病毒目標核酸的單核苷酸多態性和定量該目標核酸的方法，其包括：

提供第一探針和第二探針，其中該第一探針與該目標核酸的第一序列相同或互補，所述第一序列包含與單核苷酸多態性相對應的堿基，所述第一探針的基因序列與SEQ?ID?NO：11的序列具有至少90％的相似度；其中該第二探針與該目標核酸的第二序列相同或互補，所述第二序列不包含與單核苷酸多態性相對應的堿基，所述第二探針的基因序列與SEQ?ID?NO：12的序列具有至少90％的相似度；

通過聚合酶鏈式反應以一對引物來擴增該目標核酸，以形成一包含該第一序列和該第二序列的雙鏈核酸產物，所述的一對引物之一的基因序列與SEQ?ID?NO：9的序列具有至少90％的相似度，以及所述一對引物的另一引物的基因序列與SEQID?NO：10的序列具有至少90％的相似度；

在反應液中將所述核酸產物分別與該第一探針和第二探針雜交，以分別形成第一雙鏈和第二雙鏈，其中該第一探針與第一熒光團共價結合，該第二探針與第二熒光團共價結合，其中該第一熒光團和該第二熒光團之一為熒光團供體，另一為熒光團受體，使得當該第一探針和第二探針與該目標核酸產物雜交時，該熒光團供體與該熒光團受體處于鄰近位置，且其兩者之間能夠進行熒光共振能量轉移(FRET)；

加熱該反應液，使得其溫度高于該第一探針和其互補序列所形成的雙鏈的解鏈溫度；

鑒定該單核苷酸多態性，通過用激發光照射該熒光團供體，并監測該第一探針的熒光團受體發出的熒光量的變化，該熒光量變化是升高的溫度值的函數；和

通過監測該熒光團受體所發出的熒光來定量該目標核酸。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述定量步驟是將該熒光團受體所發出的熒光強度與一預定值比較。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，第一探針和第二探針與所述核酸產物的同一鏈雜交。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，第一探針和第二探針與所述核酸產物的同一鏈雜交。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，該鑒定步驟包括：

建立該第一雙鏈的一級導數解鏈曲線；

確定該曲線的解鏈峰值所對應的溫度值；

比較該溫度值與該雙鏈的解鏈溫度，其中該雙鏈是由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值比該解鏈溫度低時，該目標核酸中存在一單核苷酸多態性，若該溫度值與該解鏈溫度相同時，則不存有單核苷酸多態性。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該鑒定步驟包含：

建立該第一雙鏈的一級導數解鏈曲線；

確定該曲線的解鏈峰值所對應的溫度值；

比較該溫度值與該雙鏈的解鏈溫度，其中該雙鏈由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值比該解鏈溫度低時，該目標核酸中存在一單核苷酸多態性，若該溫度值與該解鏈溫度相同時，則不存有單核苷酸多態性。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該定量步驟是將該熒光團受體所發出的熒光強度值與一預定值比較。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，其中該第一探針和該第二探針雜交于該核酸產物的同一鏈上。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該第一探針的基因序列是：SEQ?ID?NO：15，和所述第二探針的基因序列是SEQ?ID?NO：16。

10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，其中該一對引物之一的基因序列是：SEQ?ID?NO：13，該一對引物另一的基因序列為SEQ?ID?NO：14。

11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，其中該鑒定步驟包含：

建立該第一雙鏈的一級導數解鏈曲線；

決定該曲線的解鏈峰值所對應的溫度值；

比較該溫度值與該雙鏈的解鏈溫度，其中該雙鏈是由該第一探針與其互補序列形成，若該溫度值比該解鏈溫度低時，該目標核酸中存在一單核苷酸多態性，若該溫度值與該解鏈溫度相同時，則不存有單核苷酸多態性。

12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，其中該定量步驟是將該熒光團受體所發出的熒光強度值與一預定值比較。