[發(fā)明專利]一種兼容免疫熒光分析的細(xì)胞化學(xué)染色方法及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710001028.7
• 申請(qǐng)日: 2007-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101226118A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙曉航;何平;任傳利;鄭朝旭;趙平;王成峰;周蘭萍;許楊;喬媛媛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所;中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N1/30
• 分類號(hào): G01N1/30;G01N33/574;C12Q1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 程泳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種兼容免疫熒光分析的細(xì)胞化學(xué)染色方法及其用途。本發(fā)明還涉及一種從人外周血樣本中鑒定上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞的方法，其中采用兼容免疫熒光分析的細(xì)胞化學(xué)染色方法。本發(fā)明所述鑒定方法可從少量人體外周血樣本分離出的有核細(xì)胞中簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確地鑒定出存在于血液循環(huán)中的上皮組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞。

背景技術(shù)

目前常用的細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)的主要方法包括：瑞氏染色、姬姆匹染色、瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色、巴氏染色和蘇木素伊紅染色，相關(guān)染色技術(shù)概述如下：

瑞氏染色：瑞氏染料中含有美藍(lán)和伊紅兩種染料，前者為堿性，后者為酸性，細(xì)胞核染色質(zhì)與強(qiáng)堿性的組蛋白、精蛋白等，形成核蛋白，這種強(qiáng)堿物質(zhì)與瑞氏酸性染料伊紅有親和力，故染成紅色；但核蛋白中還有少量的弱酸性蛋白和氨基酸，它又與瑞氏染料中的美藍(lán)起作用，只因其量太少，而不顯藍(lán)色，故細(xì)胞核呈紫紅色。

姬姆薩染色：染料主要為伊紅、美藍(lán)兩種成分，染色原理與瑞氏染色相同。

瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色：由于上述兩種染色原理基本相同，混合染色法的優(yōu)點(diǎn)是，瑞氏染液對(duì)胞漿著色好，姬姆薩染液則對(duì)核著色好，兩法合并，可以兼得兩者的優(yōu)點(diǎn)。因此在細(xì)胞學(xué)的檢查中，常用兩者進(jìn)行復(fù)合染色。

巴氏染色：巴氏陰道及痰液等脫落細(xì)胞學(xué)檢查的一種主要染色方法。蘇木素對(duì)細(xì)胞核著色，其他染料可與細(xì)胞漿中不同的化學(xué)成分結(jié)合而使其著色。涂片經(jīng)巴氏染色后，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，分色明顯，透明度好，胞漿著色艷麗。缺點(diǎn)是試劑種類很多，染色手續(xù)繁雜，時(shí)間長(zhǎng)，不宜涂厚片等。

蘇木素伊紅染色：原理與巴氏染色法基本相同。適合黏液及細(xì)胞較多，較厚的涂片和切片觀察組織層次。

以上幾種細(xì)胞化學(xué)的染色方法大都強(qiáng)調(diào)對(duì)細(xì)胞核的染色，一旦對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，將無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞免疫熒光和染色體倍體分析。

為克服現(xiàn)有細(xì)胞染色技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明人采用了一種能夠適于進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光分析的細(xì)胞化學(xué)染色方法，即兼容免疫熒光分析的細(xì)胞化學(xué)染色方法。所述兼容免疫熒光分析的細(xì)胞化學(xué)染色方法，是一種改進(jìn)的蘇木素細(xì)胞染色方法在采用蘇木素對(duì)細(xì)胞核的染色同時(shí)，不影響后續(xù)的細(xì)胞表面標(biāo)志物的免疫熒光分析和染色體倍體的DNA原位雜交分析，適用于多種細(xì)胞類型的染色，包括胚胎時(shí)期內(nèi)胚層、中胚層和外胚層分化的所有類型的正常細(xì)胞，尤其適用于針對(duì)人類血液樣本中存在的上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞多種不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。

尸檢發(fā)現(xiàn)人類血液中存在上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞的現(xiàn)象已近百年，根據(jù)其特性又稱之為血液稀有細(xì)胞、腫瘤微小轉(zhuǎn)移病灶、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和循環(huán)上皮細(xì)胞等。

通常，血液中可能出現(xiàn)的上皮組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞涉及覆蓋于身體表面和襯貼在有腔器官腔面的被覆上皮(如，皮膚、消化管、呼吸系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng))和具有分泌功能的腺上皮(如，肝臟、胰腺、甲狀腺、腎上腺)來(lái)源的實(shí)體腫瘤。

動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液中上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和變化，間接了解腫瘤治療療效與進(jìn)展，具有重要的科學(xué)意義和廣泛的臨床應(yīng)用前景。對(duì)血液中上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞鑒定和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，能夠間接了解腫瘤尤其是實(shí)體腫瘤的進(jìn)展與治療療效。例如，監(jiān)測(cè)乳腺癌患者外周血樣本中上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞數(shù)目可以間接判斷患者預(yù)后。通常認(rèn)為，轉(zhuǎn)移乳腺癌患者7.5ml外周血具有≥5個(gè)腫瘤細(xì)胞者較7.5ml外周血＜5個(gè)腫瘤細(xì)胞者的無(wú)進(jìn)展生存期和總體生存期大為縮短^[1]。

研究表明，進(jìn)入血液的上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞主要有三種存在形式：①以完整細(xì)胞形式存在并處于靜止增殖狀態(tài)；②在各種剪切力作用下細(xì)胞膜破裂以裸核形式存在，繼而逐步凋亡；③以完整細(xì)胞形式存在，在特定條件下進(jìn)入活躍增殖狀態(tài)并錨定于靶器官的毛細(xì)血管。

檢測(cè)外周血樣本上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞的技術(shù)一般要求具有微創(chuàng)、實(shí)時(shí)、快捷、受試者易于接受等特點(diǎn)，主要涉及獲得與富集血液中非血細(xì)胞來(lái)源的有核細(xì)胞，并從中鑒定上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞等兩個(gè)步驟。具體的，目前有多種方法可以有效的分離和富集血液中非血細(xì)胞來(lái)源的有核細(xì)胞，其中以免疫磁珠富集技術(shù)應(yīng)用最為廣泛；而鑒定上皮組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞，目前主要采用抗上皮細(xì)胞表面抗原聯(lián)合抗腫瘤相關(guān)抗原的免疫熒光染色法，例如分別用紅、綠熒光素標(biāo)記抗上皮細(xì)胞抗原(EpCAM和cytokeratins?8，18，和/或19)、抗白細(xì)胞表面抗原(CD45)和抗腫瘤相關(guān)抗原(CA19-9、CEA、HER2/neu、粘蛋白、β-hCG、甲胎蛋白、PSA和PSMA等)染色，繼而用DAPI染料對(duì)細(xì)胞核DNA復(fù)染等聯(lián)合判定^[2-3]。