[發明專利]一種兼容免疫熒光分析的細胞化學染色方法及其用途

有效

• 申請號: 200710001028.7
• 申請日: 2007-01-19
• 公開（公告）號: CN101226118A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發明（設計）人: 趙曉航;何平;任傳利;鄭朝旭;趙平;王成峰;周蘭萍;許楊;喬媛媛
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院腫瘤研究所;中國人民解放軍海軍總醫院
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N33/574;C12Q1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 程泳

1.一種兼容免疫熒光分析的細胞化學染色方法，其特征在于與常規蘇木素染色相比，所采用的蘇木素染液中蘇木素的濃度是現有蘇木素-伊紅染色方法中蘇木素濃度的40％-50％，同時，染色時間是現有蘇木素伊紅染色方法時間的50％-67％

2.權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法采用組成為1.3mg/ml-1.6mg/ml蘇木素、50mM硫酸鋁、1mM碘酸鈉、25％乙二醇、2％冰醋酸的蘇木素染液對樣本染色40秒-1分鐘。

3.一種有核細胞的化學染色方法，其適于對細胞進行進一步的細胞免疫熒光分析，包括步驟：

1)將細胞用40微升組成為137mM?NaCl，2.7mM?KCl，10mM?Na₂HPO₄，2mM?KH₂PO₄，pH7.4的1×PBS溶液重懸后均勻滴加在載玻片上，室溫放置至溶液剛剛揮發時為止；

2)95％乙醇固定15分鐘；

3)蒸餾水浸泡細胞玻片2分鐘，換用新鮮的蒸餾水，再洗滌2分鐘；

4)用權利要求1所述方法染色1分鐘；

5)自來水浸泡約10分鐘，洗去多余染液后再用蒸餾水洗滌一遍；

6)95％乙醇脫水5秒鐘后再以0.5％伊紅染液染色4分鐘；

7)70％乙醇洗滌2次，95％乙醇脫水2分鐘，換用新鮮的95％乙醇再脫水2分鐘，二甲苯透明5分鐘，換用新鮮的二甲苯再透明5分鐘，用中性樹膠封片。

4.權利要求1或3所述的方法，其中所述有核細胞選自胚胎時期內胚層、中胚層和外胚層分化的所有類型的正常細胞和腫瘤細胞。

5.權利要求4所述的方法，其中所述細胞選自來自于如下類型上皮來源腫瘤的細胞：唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌、腸癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、肺癌、皮膚癌、乳腺癌、外陰癌、陰道癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、輸卵管癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、腎癌、膀胱癌、尿道癌、眼瞼癌、結膜癌和淚腺癌，以及體外培養的細胞系COS-7細胞、CHO細胞、NIH3T3細胞、BHK-21細胞、HeLa細胞。

6.一種從人體外周血樣本分離出的有核細胞中鑒定上皮組織來源腫瘤細胞的方法，包括如下步驟：

1)細胞滴片制備及染色：針對有核細胞樣本經細胞滴片、固定后進行權利要求1所述的兼容免疫熒光分析的細胞化學染色；

2)細胞形態學分析：經光學顯微鏡鏡檢，判定屬于典型上皮組織來源腫瘤細胞的個數；對無法判定的可疑細胞，記錄細胞所在位置；

3)細胞表面標志分析：對步驟2)中獲得的可疑細胞進行免疫熒光染色，判定其中屬于上皮組織來源腫瘤細胞的個數，對無法判定的可疑細胞，記錄細胞所在位置。

7.權利要求6所述的方法，其中還包括：

4)染色體倍體分析：根據所測樣本的腫瘤類型，采用選自1～3個針對所述上皮組織來源腫瘤之特異性高頻擴增染色體著絲粒區域的染色體計數探針，經熒光基團標記后，與步驟3)中的可疑細胞DNA原位雜交，熒光顯微鏡下觀察步驟3)中所述可疑細胞的特異染色體拷貝數，判定屬于上皮組織來源腫瘤細胞的個數；

8.權利要求6所述的方法，其中所述兼容免疫熒光分析的細胞化學染色與常規蘇木素染色相比，所采用的蘇木素染液中蘇木素的濃度是現有蘇木素-伊紅染色方法中蘇木素濃度的40％-50％，同時，染色時間與現有蘇木素-伊紅染色方法相比也縮短了50％-67％

9.權利要求8所述的方法，其特征在于所述兼容免疫熒光分析的細胞化學染色采用組成為1.3mg/ml-1.6mg/ml蘇木素、50mM硫酸鋁、1mM碘酸鈉、25％乙二醇、2％冰醋酸的蘇木素染液對樣本染色40秒-1分鐘。

10.權利要求6所述的方法，其特征在于步驟3)所述細胞表面標志分析采用量子點標記抗體，對獲自步驟2)中待鑒定的可疑細胞進行免疫熒光染色。

11.權利要求10所述的方法，其中采用用量子點分別標記兩種所述上皮來源腫瘤代表性的抗上皮細胞表面抗原和抗腫瘤相關抗原抗體以及一種抗白細胞表面抗原抗體。

12.權利要求6所述的方法，其中所述上皮組織來源腫瘤細胞的來源選自唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌、腸癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、肺癌、皮膚癌、乳腺癌、外陰癌、陰道癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、輸卵管癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、腎癌、膀胱癌、尿道癌、眼瞼癌、結膜癌和淚腺癌。