[發明專利]淀粉吸附區域及其用途

無效

• 申請號: 200680056250.0
• 申請日: 2006-10-31
• 公開（公告）號: CN101605809A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發明（設計）人: 張大慈;呂平江;孫玉珠;許嘉欽
• 申請（專利權）人: 善笙生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/37
• 分類號: C07K14/37;C07K1/22;C12P19/14;C12N9/30;C12N15/62;C12N15/66
• 代理公司: 北京連和連知識產權代理有限公司
• 代理人: 賀小明

技術領域

本發明涉及淀粉吸附區域，重組蛋白質及其組合物。本發明還涉及分離包含淀粉吸附區域的重組蛋白質的方法。

背景技術

利用微生物系統表達蛋白質已成為制造高價、重要醫藥蛋白質的主要來源，而如何純化和回收重組蛋白質則為發酵工藝設計上的重要考慮。傳統的蛋白質純化方法可用以純化單一產物，改良的方法，更進一步包括使用重組蛋白質。重組蛋白質可通過親和性管柱層析法加以純化，所欲純化之重組蛋白質之成份可通過其與親和性基質上結合的多肽形成共價性鏈接而被純化。

某些系統通過親和性管柱層析的原理來分離蛋白質。

美國專利第5643758號揭示一種包含麥芽糖結合蛋白質(MBP)的系統。將克隆基因插入pMAL載體內可產生MBP的malE基因下游。將此載體轉載至宿主細胞，在宿主細胞中表達該重組蛋白質。將細胞溶離物或培養基分層載入含有親和性基質-直鏈淀粉的管柱中并洗滌數次，再使用大量的麥芽糖溶離重組蛋白質。

美國專利第5202247號說明一種包含纖維素吸附區域的系統。纖維素管柱可用于純化含有纖維素吸附區域的重組蛋白質。將細胞溶離物或培養基分層載入該管柱并加以洗滌。纖維素吸附區域和纖維素間的交互作用來自于彼此間在中性pH值下的疏水性交互作用所產生。一般使用低極性溶液，如乙二醇，進行溶離，之后再以透析和過濾移除低極性溶劑。

此等現行的蛋白質純化系統的缺點包括：其純化過程不方便且費力、用于純化的管柱昂貴。此等蛋白質純化系統的限制包括：不能在某些條件之下純化重組蛋白質，例如：含EDTA的樣本、使用的蛋白質卷標比標的蛋白質大，而本發明的蛋白質標簽較現有的蛋白質標簽小。

發明內容

本發明涉及一種淀粉吸附區域(starch?binding?domain)，其具有如下顯示于SEQ?ID?Nos.1、2或3的氨基酸序列；

SEQ?ID?No.1：

ASIPSSASVQ?LDSYNYDGST??FSGKIYVKNI??AYSKKVTVVYADGSDNWNNN?????GNIIAASFSG??PISGSNYEYW??TFSASVKGIKEFYIKYEVSG?KTYYDNNNSA?NYQVSTS；

SEQ?ID?No.2：

ASIPSSASVQ?LDSYNYDGST??FSGKIYVKNI??AYSKKVTVIYADGSDNWNNN?????GNTIAASYSA??PISGSNYEYW??TFSASINGIKEFYIKYEVSG?KTYYDNNNSA?NYQVSTS；或

SEQ?ID?No.3：ASIPSSASVQ?LDSYNYDGST?FSGKIYVKNIAYSKKVTVIY??ANGSDNWNNN??GNTIAASYSA?PISGSNYEYWTF?SASINGIK?EFYIKYEVS?G?KTYYDNNNSA?NYQVSTS；

或其SEQ?ID?NO.1、2或3的等位變體及衍生物，其具有淀粉吸附能力者。

本發明中的淀粉吸附區域可取得自同類的碳水化合物結合模塊(Carbohydrate?Binding?Module)，如：CBM20或CBM21。本發明一實施例中，淀粉吸附區域可取自CBM21葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附區域。本發明較佳的實施例中，淀粉吸附區域可取自根霉屬(Rhizopus?spp.)。本發明的更佳實施例中，淀粉吸附區域可取自根霉屬(Rhizopus?spp.)的葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附區域。

本發明的淀粉吸附區域包含配體結合位置(或碳水化合物結合位置)，該部位位于芳香性基團上，而該芳香性基團則位于用以和碳水化合物結合的氨基酸序列上第32、47、58、67、83、93和94殘基的酪氨酸或/及色氨酸上。本發明的較佳實施例中，活性位點為殘基32酪氨酸、殘基47色氨酸、殘基58酪氨酸、殘基83酪氨酸、殘基93酪氨酸和殘基94酪氨酸。

本發明還涉及一種重組蛋白質，其包含下列序列：

(SBD)m-Ln-X-L’p-(SBD)q

SBD指淀粉吸附區域，L指連接子，L’指連接子，X指目標蛋白質或多勝肽，m為0、1或2，n為0或1，p為0或1，q為0、1或2，其中m和q不會同時為0。

本發明的較佳實施例中，該連接子為RoLK(Rhizopus?oryzae?GA的連接子)；PH：六個組氨酸；PK：八個賴氨酸；PPT：一個蘇氨酸及四個脯氨酸-蘇氨酸重復序列[T(PT)4]；或58L：在載體pET39b(+)上介于限制酶切位SpeI及NcoI間的區域。