[發(fā)明專利]在酵母表達(dá)系統(tǒng)中增強(qiáng)重組外源蛋白的分泌效率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200680055047.1
• 申請(qǐng)日: 2006-06-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101473035A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林瀅權(quán);金圣根
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/04;C12N9/38
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在酵母表達(dá)系統(tǒng)中提高重組外源蛋白的分泌效率的方法。

背景技術(shù)

利用微生物大量產(chǎn)生外源蛋白是蛋白質(zhì)藥業(yè)中最重要的技術(shù)領(lǐng)域。為 了回收和純化期望的產(chǎn)物，重組外源蛋白可被胞內(nèi)表達(dá)，或者另外可被胞 外分泌。胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)在許多情況下經(jīng)常可導(dǎo)致蛋 白質(zhì)以非活性和水不可溶的形式在胞內(nèi)累積，并可帶來(lái)產(chǎn)率降低因素的各 種劣勢(shì)，諸如破裂固體微生物的繁瑣的過(guò)程以及從存在于細(xì)胞中的各種宿 主蛋白分離期望蛋白的復(fù)雜和艱難的純化過(guò)程。然而，期望蛋白的胞外分 泌可提供容易的方式來(lái)避免與前述胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)相關(guān)的困難和問(wèn)題。而 且，由于胞外蛋白分泌僅在緊接轉(zhuǎn)錄過(guò)程之后蛋白質(zhì)的正確折疊和修飾之 后才可成功進(jìn)行，所以經(jīng)由胞外分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)生提供了能夠獲得活性形 式的、具有正確的三級(jí)結(jié)構(gòu)的可溶蛋白這一益處。因此，可以說(shuō)，在蛋白 質(zhì)產(chǎn)率以及蛋白質(zhì)質(zhì)量調(diào)控方面，蛋白質(zhì)的胞外分泌優(yōu)于重組外源蛋白的 胞內(nèi)累積系統(tǒng)。

然而，在許多情況下，在采用強(qiáng)啟動(dòng)子的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，胞外 蛋白分泌系統(tǒng)經(jīng)常遭受相比于胞內(nèi)累積系統(tǒng)顯著低的表達(dá)和分泌水平。為 了克服胞外分泌的這類劣勢(shì)和問(wèn)題，已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，以增強(qiáng)蛋白質(zhì) 的胞外分泌收率。大多數(shù)研究集中于直接優(yōu)化信號(hào)序列以有效分泌蛋白或 發(fā)現(xiàn)新的強(qiáng)分泌信號(hào)序列(Nucleic?Acids?Res?Suppl.，2003(3)：261-2；和 Biochem?Cell?Biol.1993，71：401-5)。

作為另一種方法，已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，以通過(guò)使用分子生物學(xué)技術(shù)， 經(jīng)由誘導(dǎo)有助于蛋白質(zhì)的折疊和水溶解的蛋白伴侶的過(guò)表達(dá)，促進(jìn)相應(yīng)于 過(guò)表達(dá)重組外源蛋白時(shí)的初始限速步驟的蛋白質(zhì)折疊以及防止可在蛋白的 胞外分泌之前發(fā)生的不溶性沉淀，而增強(qiáng)期望蛋白的分泌效率(Robinson和 Wittrup，Biotech.Prog.，11：171，1995；Robinson?et?al.，Biotechnology， 12：381-384，1994；以及Wulfing和Plukthun，Mol.Microbiol.12(5)：685-692， 1995)。

半乳糖啟動(dòng)子，傳統(tǒng)上被用于誘導(dǎo)外源重組蛋白在酵母中的表達(dá)，是 一種利用半乳糖作為誘導(dǎo)物的強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。即使蛋白表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)對(duì) 于增加外源蛋白的胞內(nèi)累積或表達(dá)水平可以是有利的，這也可導(dǎo)致在期望 胞外分泌所需蛋白質(zhì)時(shí)分泌效率下降或者細(xì)胞功能異常，原因在于在分泌 的早期在細(xì)胞中發(fā)生不溶性沉淀。這類事件偶爾也在重組表達(dá)系統(tǒng)諸如大 腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)中觀察到。為了克服這類缺點(diǎn)， 進(jìn)行了各種嘗試來(lái)降低培養(yǎng)溫度(Baneyx?F.，Curr.Opin.Biotechnol.，10： 411-421，1999；以及George?Georgiou和Pascal，Curr.Opin.Biotechnol.，7： 190-197，1996)。

然而，這類降低培養(yǎng)溫度的方法具有與重組外源蛋白產(chǎn)生成本增加相 關(guān)的劣勢(shì)，原因在于培養(yǎng)期延長(zhǎng)。因此，在本領(lǐng)域中對(duì)于開(kāi)發(fā)能夠通過(guò)調(diào) 節(jié)半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性來(lái)增強(qiáng)重組外源蛋白的分泌效率而不降低培 養(yǎng)溫度的方法存在需求。

為了這個(gè)目的，基于半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性可通過(guò)調(diào)控宿主中半 乳糖的可利用度進(jìn)行調(diào)節(jié)這一想法，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)確認(rèn)，通過(guò)使用 缺乏參與半乳糖吸收的半乳糖通透酶基因的突變株，或通過(guò)經(jīng)由共添加一 定比例的半乳糖和調(diào)節(jié)分解代謝物阻抑的葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)而培養(yǎng) 經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母菌株，提高重組外源蛋白的分泌效率是可能的。本發(fā)明基于 這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)得以完成。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問(wèn)題

因此，考慮上述問(wèn)題而做出了本發(fā)明，并且本發(fā)明的一個(gè)目的是提供 通過(guò)遺傳修飾酵母宿主菌株或改變培養(yǎng)條件而提高重組外源蛋白在酵母表 達(dá)系統(tǒng)中的胞外分泌效率的方法。

技術(shù)方案

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)提供提高外源蛋白分泌效率的方法可實(shí) 現(xiàn)上述目的和其它目的，所述方法包括步驟(a)用重組外源基因構(gòu)建體轉(zhuǎn) 化酵母宿主以構(gòu)建轉(zhuǎn)化酵母菌株，所述重組外源基因構(gòu)建體包含半乳糖誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列和編碼所述外源蛋白的基因；和(b)在所述半 乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性受到調(diào)控的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化酵母菌株。

有益效果