[發明專利]在木糖中選擇和再生轉基因芥菜的方法

無效

• 申請號: 200680053937.9
• 申請日: 2006-02-09
• 公開（公告）號: CN101400797A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: V·M·帕特爾;K·R·拉伊亞什里
• 申請（專利權）人: 阿維沙基因有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/92
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 羅菊華

發明領域

本發明描述了一種改進的產生蕓苔轉化體的方法，所述方法是在 根據遺傳轉化的芥菜(Brassica?juncea)外植體利用木糖作為唯一碳 源的能力對其進行選擇的方法的基礎上建立起來的。所述發明包括了 用構建的載體對目標宿主植物進行土壤桿菌(Agrobacterium)介導的 轉化來表達酶木糖異構酶。還公開了在用所述載體進行轉化來獲得木 糖作為碳源的代謝優勢之后，對推定的轉化體進行選擇的方法。本發 明緩解了負選擇方法的缺點。據報，使用木糖異構酶進行選擇具有穩 定的34-40％的轉化效率。

發明背景

轉基因植物的產生通常需要使用選擇系統，所述選擇系統使成功 轉化的細胞能夠再生并生長。當必須通過轉化將感興趣的核苷酸(NOI) 或感興趣的基因(GOI)引入到細胞群體中時，只有一定數量的細胞被成 功轉化，即，只有少數細胞接受了NOI或GOI。轉化的細胞只構成了 被處理細胞的較少部分，相對而言大部分細胞仍是未轉化的，因此選 擇系統在選擇成功轉化的細胞中必須能夠進行有效的篩選，這樣才能 使存在選擇性試劑時的轉基因植物的恢復幾率大于不存在選擇性試劑 時的轉基因植物的恢復幾率，尤其是因為轉化率總是低的(10^-3至 10^-6)。

選擇過程是通過和感興趣基因一起引入選擇性標記基因來進行 的。在轉化過程中使用這種選擇性標記基因目的是給予轉化的細胞選 擇優勢，使其更快、更好地生長，并殺死非轉化細胞。

理想的選擇性標記基因應該能夠在所有的細胞或組織中并且在大 多數植物物種中表達。這種表達應該能夠容易的和植物組織中的任何 內源活性相區別，使轉化和未轉化組織的表型相區分。在再生步驟中， 在選擇性培養基中頻死的非轉化細胞對轉化細胞的影響應該是微小 的。除了上面的以外，一種簡單的檢測應該能夠確證標記的存在(ACNFP， 1994)。

目前確定的、能夠使轉基因植物或細胞在轉化后被鑒定的選擇性 標記可以被分為兩類。它們是正和負標記，分別給予選擇優勢或劣勢。 負選擇殺死不含有引入的DNA的細胞，包括基于抗生素和除草劑的選 擇。它們通過在存在抗生素和除草劑的情況下的生長來選擇轉化的細 胞或組織外植體。

到目前為止，最廣泛使用的選擇性基因是新霉素磷酸轉移酶II (NPTII)基因(Fraley等人1986)，該基因提供了對氨基葡糖苷、抗生 素卡那霉素、新霉素和G418的抗性(Bevan等人1983)。基于對博來 霉素(Hille等人1986)、溴草腈(bromoxynil)(Stalker等人 1988)、氯霉素(Fraley等人1983)、2，4-二氯苯氧乙酸(Streber和 Willmitzer?1989)、草甘磷(Shah等人1986)、潮霉素(Waldron等 人1985)或草丁膦(phosphinothricin)(De?Block等人1987)的抗 性開發出了其它一些選擇系統。

依賴于使用抗生素或除草劑的負選擇方法有一些缺點。死于抗生 素毒性的植物細胞釋放生長抑制劑和毒素，這被認為會負面影響轉化 的細胞并且妨礙其生長(Haldrup等人1988a)。在存在殺植物產物時 未轉化細胞會被殺死，并且在使用粘接組織(coherent?tissue)時存 在轉化細胞也死亡的危險，因為未轉化細胞的死亡會截斷對轉化細胞 的營養供應，或者是由于未轉化細胞的損傷或死亡會分泌毒性化合物， 因此限制了負系統的轉化效率。此外，使用負選擇進行細胞或組織的 選擇需要對引入基因的表達相對于選擇過程進行精確計時。如果在解 毒基因表達前或者產生足夠的基因產物來改變毒性化合物的作用之 前，用毒性化合物處理轉基因細胞，轉基因和非轉基因細胞都會被殺 死。如果選擇延遲了，可能會因為，例如，從非轉基因細胞或組織中 形成芽或愈傷組織，這會阻礙用于選擇轉化細胞的化合物的滲透，從 而阻礙轉基因細胞或組織的選擇。它們引起基因組規模的DNA甲基化 改變(Schmitt等人1997)。這種不可逆表型導致基因的沉默，并且 被認為會阻礙轉基因細胞的選擇和植物再生過程。甲基化的改變可以 是劑量依賴的，并且導致序列突變(Bardini等人2003)。