[發(fā)明專利]在木糖中選擇和再生轉(zhuǎn)基因芥菜的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680053937.9
• 申請日: 2006-02-09
• 公開（公告）號: CN101400797A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發(fā)明（設計）人: V·M·帕特爾;K·R·拉伊亞什里
• 申請（專利權）人: 阿維沙基因有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/92
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 羅菊華

1.一種新型的和改進的、基于正選擇和再生方法的生成芥菜 (Brassica?juncea)轉(zhuǎn)化體的方法，包括：

(a)構建重組載體，所述載體導入了可分離地與調(diào)節(jié)序列連接的 編碼代謝選擇試劑木糖所需要的木糖異構酶的核酸序列；

(b)土壤桿菌介導的、在優(yōu)化的感染條件下使所述載體進入植物 細胞或植物組織的轉(zhuǎn)化方法；

(c)在含有步驟(a)的選擇試劑的MS培養(yǎng)基中，從遺傳未轉(zhuǎn)化的 植物細胞或植物組織群體中，選擇推測的轉(zhuǎn)化體的步驟；

(d)再生選擇的植物細胞或組織的步驟。

2.根據(jù)權利要求1的方法，其中使用的植物屬于芥菜物種。

3.根據(jù)權利要求1的方法，其中編碼木糖異構酶的核酸序列分離 自有機體裂殖壺菌(Schizochytrium)，并顯示于SEQ?ID?1中。

4.根據(jù)權利要求3的核酸序列，其中至少一種核苷酸序列被修 飾，以使在宿主植物外植體中發(fā)生修飾DNA的表達。

5.根據(jù)權利要求4的核酸序列，其中修飾的序列顯示于SEQ?ID3 中。

6.表達的蛋白質(zhì)的相應氨基酸序列顯示于SEQ?ID?2中。

7.根據(jù)權利要求1的方法，其中接受轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織獲自 于MS培養(yǎng)基中宿主植物的種子的萌芽后子葉葉柄。

8.根據(jù)權利要求1的方法，其中植物細胞/組織在用載體構建體 轉(zhuǎn)化前不能利用木糖作為唯一碳源。

9.根據(jù)權利要求1的轉(zhuǎn)化方法，其中用包含編碼木糖代謝所需的 酶木糖異構酶的核酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化的芥屬植物，其特征在于： 在轉(zhuǎn)化步驟中使用外植體的分段式共培養(yǎng)，包括：

(a)通過切割子葉葉柄來避免包含任何原基組織來制備外植體的 步驟；

(b)用攜帶有所述載體構建體的土壤桿菌感染所述外植體10秒， 并隨后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的步驟；

(c)在28℃、黑暗條件下共培養(yǎng)所述外植體3天的步驟；

(d)用含有選擇試劑的選擇培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移外植體的步驟；

(e)隨后的將選擇的外植體轉(zhuǎn)移到選擇和延長培養(yǎng)基中的步驟；

(f)進一步包括選擇的轉(zhuǎn)化體的再生的步驟。

10.根據(jù)上述權利要求的方法，其特征如下：使用已知的篩選分 子技術完成對再生的小植物中所述選擇標記基因的轉(zhuǎn)化的驗證。

11.根據(jù)任一前述權利要求的方法，其中遺傳轉(zhuǎn)化的植物外植體 攜帶有包含權利要求3的核苷酸序列的載體，其表達賦予轉(zhuǎn)化的外植 體相對于未轉(zhuǎn)化細胞的代謝優(yōu)勢。

12.根據(jù)任一前述權利要求的方法，其中根據(jù)通過權利要求3的 核酸的酶的表達所產(chǎn)生的利用選擇試劑木糖作為碳源的競爭代謝優(yōu)勢 選擇轉(zhuǎn)化的細胞。

13.根據(jù)權利要求1的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于35％。

14.根據(jù)權利要求1的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于30％。

15.根據(jù)權利要求1的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于25％。