[發明專利]用于生產L－谷氨酰胺的方法

有效

• 申請號: 200680052283.8
• 申請日: 2006-12-27
• 公開（公告）號: CN101336292A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 林干朗;前田匡毅;米谷良之
• 申請（專利權）人: 協和發酵工業株式會社
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N9/00;C12N15/09;C12P13/14
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 楊青;樊衛民

技術領域

本發明涉及用于生產L-谷氨酰胺的方法。

背景技術

作為通過發酵生產L-谷氨酰胺的方法，涉及具有重氮絲氨酸 (azaserine)抗性的棒桿菌的方法(參見專利文獻1)、涉及具有6-重氮 -5-氧-正亮氨酸抗性的棒桿菌的方法(參見專利文獻2)等等是已知的。 另外，作為通過增強谷氨酰胺合成酶活性而生產L-谷氨酰胺的方法， 涉及受腺苷酰化調控的谷氨酰胺合成酶-腺苷酰轉移酶活性降低的棒狀 桿菌的方法(參見非專利文獻1，專利文獻3)，和其中受到腺苷酰化 的谷氨酰胺合成酶第405位氨基酸被取代的棒桿菌以及PII蛋白活性降 低的棒桿菌的方法(參見非專利文獻2，專利文獻3)，都是已知的。

已經知道，除了編碼谷氨酰胺合成酶的glnA之外，在棒桿菌基因 組上存在編碼與谷氨酰胺合成酶具有同源性的谷氨酰胺合成酶2的 glnA2。據報導，由棒桿菌的glnA2編碼的多肽與不受腺苷酰化調控的 枯草桿菌(Bacillus?subtilis)的谷氨酰胺合成酶具有高度同源性，但是當 編碼受腺苷酰化調控的谷氨酰胺合成酶的glnA失活時(參見非專利文 獻1)，棒桿菌顯示谷氨酰胺營養缺陷的表型。在棒桿菌中，由glnA2 編碼的多肽不具有谷氨酰胺合成酶活性，并且迄今為止也未出現通過 修飾glnA2而生產L-谷氨酰胺的情況。

另外，據報道在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?glutamicum)中，通 過降低由ItsA編碼、并與溶菌酶敏感性相關的多肽的活性，來生產谷 氨酸(參見非專利文獻3，非專利文獻4，專利文獻4)。

專利文獻1：日本公開未審專利申請148094/80號；

專利文獻2：日本公開未審專利申請232497/91號；

專利文獻3：日本公開未審專利申請300887/02號；

專利文獻4：WO00/14241；

非專利文獻1：FEMS?Microbiology?Letters，201，91(2001)

非專利文獻2：FEMS?Microbiology?Letters，173，303(1999)

非專利文獻3：BMC?Biotechnol.，1，9(2001)

非專利文獻4：Journal?ofBacteriology，182，2696(2000)

發明內容

本發明解決的問題

本發明的目的在于提供修飾的谷氨酰胺合成酶2、編碼修飾的谷 氨酰胺合成酶2的DNA、包含該DNA的重組DNA、攜帶該重組DNA 的轉化體、染色體上包含該DNA的微生物，以及使用轉化體或微生物 生產L-谷氨酰胺的方法。

解決問題的方法

本發明涉及下列(1)至(34)。

(1)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列中源自屬于棒桿菌 的微生物的谷氨酰胺合成酶2的氨基酸序列中刪除、取代或添加了一 個或多個氨基酸，其中當多肽在野生型棒桿菌宿主細胞中表達時，與 野生型棒桿菌相比，所述多肽賦予了野生型棒桿菌更高的L-谷氨酰胺 產量。

(2)根據以上(1)所述的多肽，其包含的氨基酸序列在谷氨酰胺合 成酶2的氨基酸序列中，對應氨基酸序列SEQ?ID?NO：1的N端第64 位氨基酸位點處的氨基酸，被除了谷氨酸以外的氨基酸取代。

(3)根據以上(1)所述的多肽，其包含的氨基酸序列在谷氨酰胺合 成酶2的氨基酸序列中，對應氨基酸序列SEQ?ID?NO：1的N端第64 位氨基酸位點處的氨基酸，被除了谷氨酸以外的氨基酸取代，以及還 刪除、取代或添加了一個或多個氨基酸。

(4)根據以上(2)或(3)所述的多肽，其中除了谷氨酸以外的氨基酸 是堿性氨基酸。

(5)根據以上(2)或(3)所述的多肽，其中除了谷氨酸以外的氨基酸 是賴氨酸。

(6)根據以上(1)至(5)任意一項所述的多肽，其中屬于棒桿菌的微 生物是屬于棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、短桿菌(Brevibacterium) 屬或分支桿菌(Mycobacterium)屬的微生物。

(7)根據以上(1)所述的多肽，其中谷氨酰胺合成酶2的氨基酸序 列是氨基酸序列SEQ?ID?NO：1。