[發明專利]重組酵母中的蘋果酸生產

無效

• 申請號: 200680050452.4
• 申請日: 2006-11-01
• 公開（公告）號: CN101365782A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: A·A·溫克勒;A·F·德赫爾斯特;J·P·范迪耶肯;J·T·普隆克
• 申請（專利權）人: 泰特&萊爾組分美國公司
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/16;C12P7/46
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

發明背景

本發明總地涉及微生物的工業用途。更具體地，它涉及通過酵母 生產蘋果酸或琥珀酸。

在進行工業加工中使用微生物如酵母已經不知不覺地進行了數千 年，并且成為學術調查的課題也有幾十年了。酵母如啤酒糖酵母 (S.cerevisiae)已經用來生產許多不同的小分子，包括有機酸。

然而，一種難以用酵母，尤其是啤酒糖酵母產生的有機酸是蘋果 酸。蘋果酸，C₄H₆O₅，是二羧基有機酸，給許多酸的(sour或tart) 食物賦予了酸味，例如青蘋果和酒。蘋果酸可用于食品加工工業，作 為酸味源用于各種食品中。在當下，我們并不知道通過酵母可以高產 量地生產蘋果酸。

發明概述

在一個實施方案中，本發明涉及一種重組酵母，其中所述酵母是 丙酮酸脫羧酶(PDC)活性陰性的(PDC陰性)，并且用編碼丙酮酸羧 化酶(PYC)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的編碼區、編碼蘋果酸 脫氫酶(MDH)的編碼區和編碼蘋果酸轉運蛋白(MAE)的編碼區進行 功能轉化，其中PYC在細胞溶膠中是活性的，其中PEP羧化酶對蘋果 酸、天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感，其中MDH在細胞溶膠中 是活性的，并在葡萄糖存在時不失活。

在另一個實施方案中，本發明涉及一種生產蘋果酸或琥珀酸的方 法，包括在含有碳源和二氧化碳源的培養基中培養重組酵母；并從該 培養基中分離蘋果酸或琥珀酸，其中所述酵母是丙酮酸脫羧酶(PDC) 活性陰性的(PDC陰性)，并且用編碼丙酮酸羧化酶(PYC)或磷酸烯 醇丙酮酸(PEP)羧化酶的編碼區、編碼蘋果酸脫氫酶(MDH)的編碼 區和編碼蘋果酸轉運蛋白(MAE)的編碼區功能轉化，其中PYC在細胞 溶膠中是活性的，其中PEP羧化酶對蘋果酸、天冬氨酸和草酰乙酸的 抑制作用不敏感，其中MDH在細胞溶膠中是活性的，并在葡萄糖存在 時不失活。

附圖簡述

以下的附圖形成了本說明書的一部分，并且用來進一步證明本發 明的某些方面。通過參照這些附圖中的一個或多個并結合在此呈現的 具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。

附圖1表明了如實施例1所述的葡萄糖和丙酮酸濃度隨培養時間 的函數變化。

附圖2表明了如實施例1所述的蘋果酸、甘油和琥珀酸濃度隨培 養時間的函數變化。

附圖3是如實施例1中所述的質粒p426GPDMDH3的圖譜。

附圖4是如實施例1中所述的質粒pRS2的圖譜。

附圖5是如實施例1中所述的質粒pRS2ΔMDH3的圖譜。

附圖6是如實施例1中所述的質粒YEplac112?SpMAE1的圖譜。

附圖7表明了實施例2、批次A中的起始生物量、葡萄糖消耗量 和丙酮酸的產生。

附圖8表明了實施例2、批次A中的蘋果酸、甘油和琥珀酸的產 生。

附圖9表明了實施例2、批次B中的起始生物量、葡萄糖消耗量 和丙酮酸的產生。

附圖10表明了實施例2、批次B中的蘋果酸、甘油和琥珀酸的產 生。

附圖11表明了實施例2、批次C中的起始生物量、葡萄糖消耗量 和丙酮酸的產生。

附圖12表明了實施例2、批次C中的蘋果酸、甘油和琥珀酸的產 生。

說明性實施方案的描述

在一個實施方案中，本發明涉及一種重組酵母，其中所述酵母是 丙酮酸脫羧酶(PDC)活性陰性的(PDC陰性)，并且用編碼丙酮酸羧 化酶(PYC)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶的編碼區、編碼蘋果酸 脫氫酶(MDH)的編碼區和編碼蘋果酸轉運蛋白(MAE)的編碼區功能 轉化，其中PYC在細胞溶膠中是活性的，其中PEP羧化酶對蘋果酸、 天冬氨酸和草酰乙酸的抑制作用不敏感，其中MDH在細胞溶膠中是活 性的，并在葡萄糖存在時不失活。