[發明專利]突變體Ⅱ型β－內酰胺酰化酶

有效

• 申請號: 200680050115.5
• 申請日: 2006-12-28
• 公開（公告）號: CN101351549A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發明（設計）人: 簡·米特斯卡·拉恩凡德;理查德·克爾曼;威廉·比杰勒威爾德;比昂卡·吉艾勒森
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 肖善強

本發明涉及突變體II型β-內酰胺酰化酶(acylase)、編碼所述酶的多 肽以及經所述多肽轉化的微生物和生產所述突變體II型β-內酰胺的方法。 本發明還涉及使用本發明的突變體II型β-內酰胺酰化酶來生產感興趣的脫 酰基化β-內酰胺化合物的工藝。

β-內酰胺抗生素構成了抗生物化合物的最重要的組，其臨床應用已有 很長的歷史。在該組中，突出的有青霉素和頭孢菌素。青霉素是多種有絲 真菌，例如，Penicillium(例如P.chrysogenum)天然生產的。頭孢菌素是 多種微生物，例如Acremonium(例如，A.chrysogenum)和Streptomyces (例如，Streptomyces?clavuligerus)天然生產的。

作為經典菌株改進技術的結果，過去數十年來，P.chrysogenum和A. chrysogenum中的抗生素生產水平也顯著增加。隨著對產生青霉素和頭孢 菌素的生物合成途徑的了解逐漸增加以及重組DNA技術的出現，已經可 以用新的工具來改進生產菌株。

β-內酰胺生物合成中涉及的很多酶已被鑒定出來，它們對應的基因也 已被克隆，如Ingolia?and?Queener，Med?Res?Rev(1989)9：245-264(生物合 成途徑和酶)以及Aharonowitz，Cohen，and?Martin，Ann?Rev?Microbiol (1992)46：461-495(基因克隆)所述。

P.chrysogenum中對青霉素進行生物合成的前兩個步驟是三個氨基酸 L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-αα-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L- 纈氨酸(V)縮合為三肽LLD-ACV，接著是該三肽環化為異青霉素N的 形式。該化合物含有典型的β-內酰胺結構。第三個步驟涉及通過酰基轉移 酶(AT)的作用用疏水側鏈代替L-5-氨基-5-羧基戊酸的親水側鏈。

在EP-A-0448180中描述，AT介導的酶促交換反應在細胞內的細胞 器——微體中發生。可通過表達脫乙酰氧頭孢菌素C合酶(EC?1.14.20.1- DAOCS，在本文中還被稱為擴環酶(expandase))的非前驅(non- precursed)P.chrysogenum轉化子形成相當大量的脫乙酰氧頭孢菌素C (DAOC)，這一現象暗示了顯著量的青霉素N——擴環酶天然底物在P. chrysogenum中的存在(Alvi?et?al.，J?Antibiot(1995)48：338-340)。但是， DAOC的D-α-氨基-己二酰基側鏈不能被容易地去除。

頭孢菌素比青霉素貴得多。一個原因在于，一些頭孢菌素(例如頭孢 氨芐(cephalexin))是通過多次化學轉化從青霉素制得的。另一原因在 于，目前僅具有D-α-氨基-己二酰基側鏈的頭孢菌素才能被發酵。在這方 面最重要的起始材料——頭孢菌素C在任何pH下都易溶于水，因此，這 暗示要使用麻煩且昂貴的柱技術來進行長且浪費的分離工藝。還必須經過 多次化學和酶促轉化，將以這種方式獲得的頭孢菌素C轉化為治療用的頭 孢菌素。