[發(fā)明專利]用丙炔基修飾的寡核苷酸的改進(jìn)的靶向核苷酸交換方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200680048972.1
• 申請(qǐng)日: 2006-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN101346465A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P·本多克;M·T·J·德博特;R·C·J·霍格斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 凱津公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 戈泊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過(guò)將寡核苷酸引入細(xì)胞來(lái)特異性和選擇性改變?cè)诎? 細(xì)胞中DNA的特異位點(diǎn)的核苷酸序列的方法。結(jié)果是靶向交換了一個(gè) 或多個(gè)核苷酸，使得靶DNA的序列被轉(zhuǎn)變成其中它們是不同的寡核苷 酸的序列。更特別地，本發(fā)明涉及使用修飾的寡核苷酸的靶向核苷酸 交換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及寡核苷酸和試劑盒。本發(fā)明還涉及所述方法 的應(yīng)用。

背景技術(shù)

遺傳修飾是在活細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中故意進(jìn)行改變的方法，目的是 修飾所述細(xì)胞或其中所述細(xì)胞形成其部分或形成其可以再生的有機(jī)物 的一個(gè)或多個(gè)遺傳編碼的生物學(xué)特性。這些變化可以采取遺傳物質(zhì)部 分缺失、加入外源性遺傳物質(zhì)或改變遺傳物質(zhì)的現(xiàn)有核苷酸序列的形 式。用于遺傳修飾真核生物的方法已知超過(guò)20年，并且其已廣泛用于 植物、人類和動(dòng)物細(xì)胞及微生物中以改善農(nóng)業(yè)、人類健康、食品性質(zhì) 和環(huán)境保護(hù)方面。遺傳修飾的常見方法包括加入遺傳修飾的常規(guī)方法， 包括將外源性DNA片段加入細(xì)胞的基因組中，然后，其將賦予那些細(xì) 胞或其有機(jī)體超過(guò)現(xiàn)有基因編碼的性質(zhì)的新性質(zhì)(包括其中現(xiàn)有基因的 表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用)。盡管許多這樣的實(shí)例在獲得期望的性質(zhì)中 是有效的，然而，這些方法不是非常精確，因?yàn)槠洳荒芸刂破渲型庠? 性DNA片段插入在基因組的位置(并從而高于表達(dá)的最終水平)，和因 為預(yù)期效果將表明其本身高于由原始的和正常的基因組編碼的天然性 質(zhì)。相反地，將引起在預(yù)先確定的基因組基因座中的核苷酸加入、缺 失或轉(zhuǎn)化的遺傳修飾的方法允許精確地修飾現(xiàn)有基因。寡核苷酸定向 靶向核苷酸交換(TNE，有時(shí)稱為ODTNE)是基于將合成的寡核苷酸(由 核苷酸樣部分的短鏈(short?stretches)組成的分子，其類似于在其 Watson-Crick堿基配對(duì)性質(zhì)中的DNA，但可能與DNA在化學(xué)上不同) 遞送至真核生物細(xì)胞核的方法(Alexeev?and?Yoon，Nature?Biotechnol.16： 1343，1998；Rice，Nature?Biotechnol.19：321，2001；Kmiec，J.Clin.Invest. 112：632，2003)。通過(guò)故意地設(shè)計(jì)在寡核苷酸的同源性序列中的錯(cuò)配核 苷酸，可以將錯(cuò)配核苷酸結(jié)合到基因組DNA序列中。該方法允許現(xiàn)有 基因座的單個(gè)或至多幾個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)化，但是可以應(yīng)用于在現(xiàn)有基因中 建立終止密碼子從而引起其功能破壞，或建立密碼子變化從而引起具 有改變的氨基酸組成的基因編碼蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)工程)。

已經(jīng)在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞中描述了靶向核苷酸交換(TNE)。第 一個(gè)TNE報(bào)道使用了由自補(bǔ)性寡核苷酸組成的所謂嵌合體，設(shè)計(jì)該寡 核苷酸是用于插入染色體靶向位點(diǎn)。所述嵌合體包含錯(cuò)配核苷酸，該 錯(cuò)配核苷酸形成用于引入染色體靶點(diǎn)的突變的模板。為了選擇TNE事 件，大部分研究嘗試在導(dǎo)致除草劑耐藥性的內(nèi)源基因中引入單核苷酸 變化。使用嵌合體的第一個(gè)實(shí)例來(lái)自人類細(xì)胞(參見綜述Rice?et?al.， Nat.Biotech.19：321-326)。嵌合體的使用也在植物種類煙草、米和玉米 中獲得成功(Beetham?et?al.，1999?Proc.Natl.Acad.Sci.USA?96： 8774-8778；Kochevenko?et?al.，2003?Plant?Phys.132：174-184；Okuzaki?et al.，2004?Plant?Cell?Rep.22：509-512)。然而，發(fā)現(xiàn)嵌合體的活性難于 再生，因此，已經(jīng)測(cè)定了單鏈(ss)寡核苷酸的TNE活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這 些在小麥、酵母菌和人類細(xì)胞中取得了更多重現(xiàn)性的結(jié)果(Liu?et?al.， 2002?Nuc.Acids?Res.30：2742-2750；綜述，Parekh-Olmedo?et?al.，2005 Gene?Therapy?12：639-646；Dong?et?al.，2006?Plant?Cell?Rep.25：457-65)。