[發(fā)明專利]樣品上標簽的定位方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680048500.6
• 申請日: 2006-12-22
• 公開（公告）號: CN101427138A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設計）人: H·N·斯林格蘭德
• 申請（專利權(quán)）人: FEI公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N21/64;G01N23/225
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 張軼東;韋欣華

本發(fā)明涉及一種分析樣品的方法，該方法包括：

·在樣品上預備大體上平坦的表面，

·使樣品暴露于含有標簽的標示試劑，由此將標簽引入樣品中，

·獲得一系列樣品圖像，

·獲得標簽在由此所得的每個圖像中的相對位置，以及

·由如此所得的相對位置得到標簽的相對位置的三維重構(gòu)。

由電子X線斷層攝影術(shù)可了解這種方法，例如“電子X線斷層攝 影術(shù)，采用透射式電子顯微鏡的三維成像”，編者J.Frank，ISBN 0-306-43995-6中所述，進一步稱為J.Frank。在生物學和組織學中，需 要確定某些分子例如蛋白質(zhì)、抗體和核苷在例如生物樣品中的位置， 以得到關(guān)于某些過程在例如生物樣品中哪里發(fā)生并且如何發(fā)生的見 識。類似的需要出現(xiàn)在例如聚合物的分析期間。

在電子X線斷層攝影術(shù)中，在本質(zhì)上已知的儀器透射式電子顯微 鏡(TEM)中用電子束照射薄樣品，在TEM中電子束的能量通常為80- 300keV。該樣品薄得足以使電子束部分穿透它。樣品的不同部分顯示 出不同的透明度，這是由于無阻礙地通過樣品的電子量是與位置有關(guān) 的。通過形成一系列圖像，其中在各個圖像之間該樣品是傾斜的(如 此命名的傾斜系列)，并且通過收集來自這一系列圖像的數(shù)據(jù)，可制得 樣品的三維重構(gòu)。

為了成像例如生物組織中的某些結(jié)構(gòu)，可將所謂標簽連附到某些 分子上。這些標簽的特征在于它們顯示出高對比度并且其自身非常特 異性地連附到例如一定類型的抗體，而其自身沒有連附到其它類型的 抗體及其它分子。通過檢測標簽在樣品中的位置，于是可確定例如抗 體的存在和定位。

由于通過樣品的電子和構(gòu)成樣品的原子之間的相互作用與該原子 的質(zhì)子數(shù)Z非常相關(guān)，因此，特別是樣品原子組成的局部變化能夠這 樣成像。由于生物材料包括非常少的高Z原子，因此，尤其貼上含高Z 材料的標簽是非常有效的。這種標簽可以是含有蛋白質(zhì)-金絡合物的 標簽，其中金以金納米顆粒存在，其典型的直徑為1-50nm。這種標 簽在市場上可購得，例如來自Nanoprobes?Inc.，Yaphank， NY11980-9710，USA的名為NanoGold的標簽。

另一種標記方法采用熒光標簽。這些標簽響應光照射或例如電子 束照射而發(fā)出通常具有非常特定波長的熒光。利用光子探測器可探測 到如此發(fā)出的光子，由此指示在該位置存在的標簽。這種熒光標簽的 例子是例如：如此命名的半導體量子點，市售的例如來自Evident Technologies，Troy，NY?12180，USA的名稱為EviTag的標簽。有機 熒光標簽同樣也是已知的并且使用廣泛，另一種類型的(無機)標簽 被描述在例如歐洲申請EP05112781中。

人們注意到預備樣品上的平面表面以及使樣品與標示試劑相接觸 不必按照該順序進行：很可能首先將標簽供給樣品，然后預備平坦的 表面，參見“EM中的3-D金原位標記”，P.Gonzalez-Melendi等人， the?Plant?Journal(2002)Vol.29(2)，第237-243頁。

電子X線斷層攝影術(shù)的缺點是其只能用于非常薄的樣品，因為電 子必須通過樣品。通常需要小于1μm或甚至小于100nm的厚度，如 J.Frank中第25頁圖2所示。為了研究例如細胞中的某些結(jié)構(gòu)，進行 調(diào)查研究的特征必須存在于樣品中。大于樣品厚度的結(jié)構(gòu)可因此沒有 對其全部進行研究，伴有的風險是待研究的結(jié)構(gòu)在薄樣品中完全不見 了。

電子X線斷層攝影術(shù)的另一缺點是必須制作許多樣品圖像，導致 撞擊到樣品上的電子總量高。這種高總量使樣品受到損害，如J.Frank 中第3章所述。為了在進行電子X線斷層攝影術(shù)時將損害減至最小， 因此經(jīng)常必須設法使這種損害極小化，例如在低劑量條件下工作-導 致圖像中信噪比差-和/或?qū)悠防鋮s到低溫度例如液氮點或甚至液氦 點。

本發(fā)明目的是提供一種在較厚樣品中定位標簽的方法，該樣品比 現(xiàn)有技術(shù)方法中可能的厚度更厚。

為了那個目的，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于：

·各個圖像在大體上相同的方向上顯示所述的樣品，以及

·從處于該一系列圖像的各連續(xù)圖像之間的樣品中除去表面層， 留下大體上平行于最初形成的平坦表面的新表面層。