[發明專利]生產修飾（多）肽的方法

無效

• 申請號: 200680043622.6
• 申請日: 2006-09-28
• 公開（公告）號: CN101312986A
• 公開（公告）日: 2008-11-26
• 發明（設計）人: 保羅·博蒂
• 申請（專利權）人: 日內瓦大學
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107;A61K38/02;A61P35/00
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 章社杲;李丙林

技術領域

本發明涉及一種生產修飾(多)肽的方法，所述方法包括以下 步驟：在一種有機溶劑中，在一個或多個羧基上通過酯化或硫酯化， 和/或在N-端氨基酸的氨基上通過酰胺化或烷基化，對一種冠醚鍵 合(多)肽進行修飾。

背景技術

在本說明書中，引用了許多文獻，包括專利申請和制造者手冊。 將這些文獻的公開全文結合于此以供參考，而不認為其與本發明的 專利性有關。

在生物醫學領域中，存在具有改良的藥理學特性的蛋白的需 要。為此目的，已將治療蛋白結合至各種聚合物從而，例如，降低 它們的免疫原性，提高對酶促降解的抗性或延長它們的半衰期。例 如，已表明聚乙二醇化-蛋白質與聚乙二醇(PEG)的共價衍生作 用-可提高許多治療相關蛋白的生物制藥特性與臨床特性。

歐洲專利申請EP?0?809?996描述了干擾素-α的一種聚乙二醇化 的衍生物。所描述的軛合物具有一個分支的PEG結構。它是通過使 賴氨酸殘基的羰基(其依次攜帶與α-氨基和ε-氨基連接的兩個PEG 分子)與干擾素-α的一個NH基或一個OH基軛合而獲得的。明確 地提及了賴氨酸以及絲氨酸作為蛋白質上的結合位點。Roberts等 (2002)提供了關于肽與蛋白質聚乙二醇化的綜述。PEG與PEG 衍生物在蛋白質上的結合位點是NH₂以及較小范圍地是巰基。致力 于可逆的聚乙二醇化的部分提及了包括以PEG羧酸為中間產物的 酯。然而，與蛋白質的結合始終涉及氨基酸殘基的α-氨基和ε-氨基。

本領域中已知的用聚合物衍生蛋白質的化學反應常常產生永 久性鍵合(permanent?linkage)。例如，酰胺化與烷基化通常為永久 性的。更進一步地，在一些情況下，復合衍生化(multiple derivatization，多重衍生化)會導致產生活性喪失。酰胺化的可逆 性只有當氨基的保護基用于攜帶將與蛋白質結合的分子時才可實 現(Tsubery等(2004))。

在藥物化學中，酯化作用已被用于獲得緩釋型藥物(例如緩釋 形式的可的松)并且親脂醇的酯化作用可用于實現增強的吸收(例 如，諸如匹氨西林和肽氨西林的盤尼西林酯)。在第一種情況下， 關鍵效果(key?effect)是酯化藥物或前藥是無活性的。活性形式隨 后通過酯的水解作用得到緩慢釋放。在第二種情況下，酯化作用的 相應效果是去除羧酸鹽的電荷以及由酯的親脂醇部分產生的增強 的親脂性。然而，對可的松和盤尼西林進行修飾所采用的方法不可 轉用于蛋白質的修飾。

肽和蛋白質的脂質化被用于獲得改良的粘膜滲透(增強的吸收 與遞送)，從而提高生物藥效率并且在一些情況下產生增強的潛能 (Wang，J.et?al.，Pharm?Res.19，609-14(2002)；Hartley，O.et?al.， PNAS，101，16460-16465(2004))。然而，用標準方法進行的蛋白質的 脂質化通常是永久性的(不可逆的)且常常(當產生酰胺鍵或氨基 甲酸乙酯鍵時)導致蛋白質沉淀。此外脂質通常難溶于水并且很難 使蛋白質與脂質以可再生和可控制方式功能化。

Yamada等(2002)描述了套索冠醚(或冠醚)用于細胞色素C 在甲醇中增溶的應用。作者調研了冠醚的衍生對于細胞色素C增溶 效率的影響。增溶的目的是提供溶解于有機溶劑中的細胞色素C， 值得注意的是作者旨在提供在有機溶劑中發揮作用的有效的生物 催化劑。Oshima等(2002)研究了作為生物聚合物的識別工具的 杯芳烴衍生物。他們調研了多種杯芳烴在富含賴氨酸蛋白的提取中 的選擇性。特定的杯芳烴用于細胞色素C的選擇性提取。描述了溶 解于氯仿中的細胞色素C表現出罕見的過氧化物酶活性。兩篇論文 都(i)探究了增溶劑的化學修飾對溶解效率的影響并且(ii)報道 了觀察到對于溶解蛋白的罕見的催化特性。Julian等(2001)也描 述了通過冠醚而溶解于有機溶劑中的細胞色素C。使用ESI-MS提 供了表明4個18-冠-6分子與蛋白質表面上暴露的賴氨酸側鏈強有 力地結合的數據。對于蛋白質一旦被溶解就會發生衍生作用，在這 些出版物中既沒有進行設想也沒有給出建議。