[發明專利]用于產生香茅醛的方法

有效

• 申請號: 200680043009.4
• 申請日: 2006-11-10
• 公開（公告）號: CN101415831A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發明（設計）人: R·施蒂默爾;T·弗里德里希;A·米勒;B·豪爾;B·羅舍
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12P7/24
• 分類號: C12P7/24
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;隗永良

檸檬醛是抗微生物的萜，它賦予植物植物如檸檬草(lemon?grass)和澳 洲檸檬桃金娘(Australian?lemon?myrtle)特征性檸檬香氣。它還可便利地作 為工業中間體例如在維生素A和E的合成中獲得。已經報道通過還原或 氧化醛基[1]、偶姻形成[2]和裂合酶活性[1，3]而對檸檬醛的幾種生物轉化。

本研究的目的是篩選使檸檬醛中α，β-不飽和碳鍵還原以產生手性產 物香茅醛的酶活性(圖1)。檸檬醛是反式異構體香葉醛與順式異構體橙花醛 的混合物，然而對這兩種異構體中任一異構體的底物專一性可能不是重要 的，因為氨基酸可以催化異構化[4]。

產物(R)-(+)-香茅醛的有價值用途是經Prins反應而后繼環合至異蒲勒 醇，隨后水合成(1R，2S，5R)-(-)-薄荷醇[5]。非生物學策略因它們受限的立體 選擇性(檸檬醛具有三個雙鍵)和對映選擇性而仍受到挑戰[6](見圖1)。

使其它a，β-不飽和羰基的碳雙鍵還原的酶已經在文獻中報道。它們主 要屬于黃素和NADPH依賴性還原酶的“老黃酶(old?yellow?enzyme)”家族， 這由Williams和Bruce[7]在可能的生物技術應用方面綜述。

另一個實例是來自紅平紅球菌(Rhodococcus?erythropolis)的香芹酮還 原酶，該酶使用未鑒定的熱穩定輔因子并且不依賴于添加的NADH或 NADPH[8]。

為檢測檸檬醛至香茅醛的生物轉化，相應酶必須有活性，還原用電子 必須可獲得，非常的疏水性底物檸檬醛必須以足夠的濃度接觸酶并且香茅 醛形成必須比任何后續的轉化更快。因此，開發了篩選策略以試驗用于檸 檬醛轉化的多種微生物。

本發明的第一個實施方案是用于通過以所選擇的來自發酵單孢菌屬 (Zymomonas)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、假絲酵母屬(Candida)、酵母 屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬 (Candida)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、根霉屬(Rhizopus)的還原酶酶促還 原檸檬醛而產生光學活性香茅醛的方法，其中還原在兩相液體系統中完成。

該方法的優選實施方案使用所選擇的來自運動發酵單孢菌 (Zymomonas?mobilis)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter?freundii)、皺落假絲 酵母(Candida?rugosa)、貝酵母(Saccharomyces?bayanus)、釀酒酵母 (Saccharomyces?cerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、產朊假絲酵母(Candida?utilis)、東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)、爪哇根霉(Rhizopus?javanicus)的還原酶。

以上提及的微生物是本領域眾所周知的并且可以通過已知方法分離或 來自公共保藏中心如ATCC和DSMZ。

運動發酵單孢菌已經尤其作為ATCC?10998、ATCC?29192、ATCC 31821、ATCC?35001、ATCC?39985保藏。弗氏檸檬酸桿菌已經尤其作為 ATCC?8090D、ATCC?11811保藏。皺落假絲酵母已經尤其作為DSM?70761 保藏。東方伊薩酵母已經尤其作為DSM?3433、DSM?6128、DSM?11956、 DSM?70075、70079保藏。

還原酶可以分離或純化的形式或作為“全細胞酶(whole-cell-enzyme)” 使用，其中所述的“全細胞酶”應當意指酶與微生物一起用于本發明的方法。 微生物也可以受到透化以改善底物、產物、輔因子轉移入和轉移出細胞。

術語“還原酶”應當不僅意指分離的酶，還意指包含酶的提取物、溶 液或混懸液、其中酶已被固定的載體和含有酶的全細胞。

本發明的改良實施方案是利用因檸檬醛的同時還原而氧化的輔因子。 作為輔因子，可以在本發明方法的條件下氧化的每種物質都是合適的。

優選的輔因子系統是可以在等摩爾或甚至更高的量上使用或可以通過 已知系統如電化學方法或酶再生系統如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進行再生的 NADH或NADPH。若再生輔因子，則在該方法中優選低于等摩爾的量。