[發(fā)明專利]單鏈引物-啟動(dòng)子-選擇子構(gòu)建體的IVT的應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200680041636.4
• 申請(qǐng)日: 2006-09-21
• 公開（公告）號(hào): CN101589154A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邁克爾·休;娜塔莉亞·科澤瓦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 佰爾瑞溶液有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/34
• 分類號(hào): C12P19/34
• 代理公司: 北京安信方達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 楊淑媛;鄭 霞

相關(guān)申請(qǐng)

本專利申請(qǐng)要求2005年9月21號(hào)提交的60/719063號(hào)美國臨時(shí)申請(qǐng) 的優(yōu)先權(quán)。

潛在政府利益聲明

本發(fā)明開發(fā)的部分資助來源于美國軍隊(duì)實(shí)施的一個(gè)項(xiàng)目下的SBIR(小 型商業(yè)創(chuàng)新研究)，授權(quán)號(hào)為DAMD17-03-C0047C。政府可能擁有本發(fā)明中 的一些權(quán)利。

發(fā)明背景

利用體外轉(zhuǎn)錄(即IVT)進(jìn)行mRNA或基因組DNA的線性擴(kuò)增，是公知 的分子生物學(xué)方法(參見Krieg?&?Melton，1984；Melton，1984)。對(duì)于 每一個(gè)靶標(biāo)，IVT產(chǎn)生與該靶標(biāo)起始拷貝數(shù)成比例的RNA產(chǎn)物數(shù)，所以它 可以用于相對(duì)信使豐度的確定(5,545,522、5,716,785、5,891,636號(hào)美 國專利，Van?Gelder等，1990)，并且由此已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析 (5,514,545號(hào)美國專利)。IVT也是某些能夠檢測(cè)低水平病原體RNA或 mRNA的靶標(biāo)指數(shù)擴(kuò)增的等溫方法中的一個(gè)中心環(huán)節(jié)(5,399,49號(hào)美國專 利，0368906B2號(hào)歐洲專利，Guatelli等，1990)。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，如6,291,170號(hào)和5,514,545號(hào)美國專利，以及 2005/0130194號(hào)和2005/0123943號(hào)美國專利申請(qǐng)所公開的技術(shù)，常規(guī)的 步驟順序如下：進(jìn)行cDNA合成，多用一個(gè)與RNA聚腺苷酸3’末端互補(bǔ) 的引物，所述RNA的5’末端包括T7啟動(dòng)子序列(非模板鏈)；可選地， 序列或基因特異性引物可以置于除5’末端以外的位置。在RNA酶H消化 RNA模板或熱變性RNA-DNA雜合體之后，進(jìn)行第二鏈DNA的合成 (Goubler，U.，1983)，產(chǎn)生全長或部分長度的雙鏈DNA(依賴于引物放 置)，該雙鏈DNA中引入了一個(gè)雙鏈T7啟動(dòng)子序列(以及相鄰區(qū)域)。在 該方法的實(shí)際實(shí)現(xiàn)的過程中，必須向反應(yīng)物加入DNA聚合酶或RT以有效 催化第二條鏈的合成(參見5,545,522號(hào)美國專利，描述了大腸桿菌(E. Coli)DNA聚合酶的使用；Kwoh等，1989)。反義RNA(aRNA)通過 體外轉(zhuǎn)錄從第二條鏈合成，aRNA產(chǎn)物通過例如與捕獲寡核苷酸探針雜交 來檢測(cè)，包括變式如分子信標(biāo)(Vet，J.A.M.，2002；也可見BioArray?Solutions 的專利申請(qǐng)，序號(hào)11/218838，提交日期2005年2月9日，如下)或雜交 保護(hù)試驗(yàn)(參見6,004,745號(hào)美國專利，Arnold等)，或者探針延伸。該領(lǐng) 域的所有這些方法都需要從最初的mRNA靶標(biāo)合成雙鏈cDNA，以及插入 RNA降解步驟。這些方法復(fù)雜而費(fèi)時(shí)的步驟實(shí)際上將它們局限在實(shí)驗(yàn)室研 究中。在臨床條件下，運(yùn)用如此復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)方法需要對(duì)有資格操作如此復(fù) 雜的(神秘的)分析的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行特殊訓(xùn)練，并通常要認(rèn)證。

核酸檢測(cè)和序列分析-IVT還可以用于DNA分析，包括突變或多態(tài) 分析。通常，這些應(yīng)用需要對(duì)基因材料(即基因組DNA)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增， 多采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Syvanen，A.C.，2005；參見，例如4,683,202號(hào)美國 專利，Mullis)或多種變式的全基因組擴(kuò)增(參見，例如USCD關(guān)于連接 介導(dǎo)的全基因組擴(kuò)增的專利，美國專利號(hào)為5,686,243)。IVT提供了一種 PCR擴(kuò)增之后的鏈選擇的方法(參見，例如BioArray?Solutions在2005年2 月9日提交的專利申請(qǐng)，序號(hào)11/218838，提交(IVT))，該方法尤其具有 下述優(yōu)點(diǎn)：容許該步驟和隨后在IVT反應(yīng)中產(chǎn)生的RNA鏈的多重檢測(cè)相 結(jié)合。

簡(jiǎn)化和加速可信的多重?cái)U(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng)，用適合臨床條件的更簡(jiǎn)單更 穩(wěn)健的實(shí)驗(yàn)方法替換基因表達(dá)分析(5,514,545號(hào)美國專利)和其它核酸分 析任務(wù)的復(fù)雜過程，將非常有用。尤其在那種情況下，開發(fā)整合多個(gè)分析 步驟的整合實(shí)驗(yàn)方法也會(huì)有用，所述整合優(yōu)選以允許實(shí)現(xiàn)相同測(cè)定形式 (homogeneous?assay?format)的方式。為了縮短完成測(cè)定需要的時(shí)間，尤 其是實(shí)際操作的時(shí)間，通過多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)以整合擴(kuò)增和分析過程將 特別有用。并且，步驟的整合，最好是以與實(shí)現(xiàn)相同測(cè)定形式相容的方式， 將推進(jìn)小型化，這反過來將減少試劑的消耗和以及樣品和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的污 染。

IVT反應(yīng)，特別是本文所描述的利用單鏈模板(而非雙鏈模板)的IVT 反應(yīng)，具有上述優(yōu)勢(shì)中的許多優(yōu)勢(shì)。