[發明專利]雙熒光報道基因構建物和測量翻譯再編碼的測定

無效

• 申請號: 200680040551.4
• 申請日: 2006-08-30
• 公開（公告）號: CN101384720A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發明（設計）人: T·S·卡德諾;W·P·塔特
• 申請（專利權）人: 奧塔哥創新有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 戈 泊

技術領域

本發明屬于生物測定的領域，并涉及雙報道基因再編碼構建物和 方法。這樣的構建物和方法可用于篩選經由調節再編碼而起作用的藥 物。

背景技術

具有單條信使RNA(mRNA)通過稱為“再編碼”的過程翻譯成 多于一種蛋白質的實例?！霸倬幋a”是通過建于mRNA序列內的特定 位點和信號而暫時改變翻譯解碼法則的現象。在再編碼的某些情況中， 特別的信號位于信使3’的遠端，但在再編碼的最公知的情況中，所述 信號緊鄰所述再編碼位點。在哺乳動物細胞中，已經描述了三類再編 碼。

第一類，終止密碼子到有義密碼子的重新定義允許含硒代胱氨酸 的蛋白質的合成和在許多RNA病毒，如Moloney小鼠白血病病毒 (Yoshinaka?et?al.，1985，PNAS，82，1618-22)中延長的蛋白質的合成。

第二類，+1移碼調控鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白的表達。該系統自動 調控并依賴于聚胺類的濃度(Hayashi?et?al.，1996，Trends?Biochem?Sci， 27-30)。

第三類，用-1移碼來合成在不同讀碼框內具有gag(pro)和pol 基因的反轉錄病毒內的GagPol前體多聚蛋白。范例包括人免疫缺陷病 毒類型1(HIV-1)gag-pol移碼(Parkin?et?al.，1992，J.Virol.66， 5147-5151)。

為了幫助在信使RNA內發出再編碼信號的元件的研究，已經開發 了數個報道基因系統。在某些系統中，通過分析經由SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳分離的.sup.35?S-met-標記的翻譯產物評價再編碼。已經開發了 用于體內研究的使用氯霉素乙?；D移酶(cat)或螢火蟲熒光素酶的 數個酶報道基因測定方法。大多數早期的移碼測定方法使用了用在酵 母或細菌細胞內的體外或體內的雙熒光素酶報道基因。盡管熒光素酶 提供了良好的靈敏度，這樣的系統具有需要昂貴緩沖液的缺點。

使用熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)作為報道基因提供了潛在的 優點，因為它不需要昂貴的緩沖液并且進一步的因為更迅速的試驗設 定和讀取次數而使節省時間成為可能。然而，使用熒光蛋白作為報道 基因的明顯缺點是典型地不具有輸出信號的放大并且作為結果，其靈 敏度低于基于酶如熒光素酶的報道基因的靈敏度。

在細菌細胞內的測定中已經使用了熒光蛋白，但據本發明人所知， 還沒有開發出成功用在哺乳動物細胞內的使用熒光蛋白作為報道基因 的雙重報道基因移碼構建物或測定方法。

再編碼測定方法在藥物篩選中具有應用來鑒定用來治療人類中涉 及在有機體的生命周期中依賴這樣的移碼系統的有機體的失調的化合 物。因此在哺乳動物細胞而不是在酵母或細菌細胞中執行這樣的測定 會是有益的。

當解碼HIV-1?RNA時人核糖體向后滑移，從而移位它的三字母讀 碼框，并且該現象在它遇見滑移位點的次數的大約5-10％發生。這個 比率對病毒的生活力是基本的，不僅確保它的結構和酶蛋白的正確比 率，還確保病毒顆粒的正確組裝。該滑移是-1移碼的實例。HIV-1?RNA 中的兩個元件，滑移七聚體序列，U?UUU?UUA和臨近的第二結構元件 是關鍵的。測量試驗化合物如何影響移碼效率的測定具有開發這個移 碼為潛在抗病毒目標的價值。

本發明的目標是提供可能用在哺乳動物細胞內的基于熒光蛋白的 翻譯再編碼報告基因構建物和測定方法。

發明內容

在第一方面，本發明提供翻譯再編碼報告基因構建物，包括

a)第一熒光蛋白編碼序列；

b)編碼不同于第一熒光蛋白的熒光蛋白的第二熒光蛋白編碼序 列；和

c)介于第一和第二熒光蛋白編碼序列間的接頭序列；

其中第一熒光蛋白編碼序列和第二熒光蛋白編碼序列是相互在框 外的但在再編碼時共表達為單條融合多肽。

在優選的實施方案中，接頭序列編碼能物理隔離共表達的熒光蛋 白的多肽，產生來源于每種蛋白的增加的熒光輸出。優選地，編碼的 接頭降低了共表達的熒光蛋白間的熒光共振能量轉移(FRET)。

優選地，該接頭編碼包含長度在2和100間，更優選地在3和75 間，更優選地在4和60間，更優選地在7和52間和最優選地在10和 20間的序列的多肽。