[發明專利]具有新切割特異性的I－CreI歸巢核酸內切酶變體及其用途

有效

• 申請號: 200680039556.5
• 申請日: 2006-10-03
• 公開（公告）號: CN101297032A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 弗雷德里克·帕克
• 申請（專利權）人: 賽萊克蒂斯公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉曉東;顧晉偉

本發明涉及一種改造出能夠切割突變I-CreI位點的I-CreI歸巢核酸 內切酶變體的方法，所述突變I-CreI位點在±8到±10位有改變。本發明 還涉及可得自所述方法的I-CreI歸巢核酸內切酶變體、編碼所述變體的 載體、經所述載體修飾的細胞、動物或植物，并涉及所述I-CreI核酸內 切酶變體及其衍生產物在遺傳工程、基因組治療和抗病毒治療中的用 途。

大范圍核酸酶是具有大(＞14bp)切割位點的序列特異性核酸內切 酶，其可引發活細胞中特定基因座的DNA雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)(Thierry和Dujon，Nucleic?Acids?Res.，1992，20， 5625-5631)。大范圍核酸酶已用于在培養的細胞和植物中刺激其靶序列 周圍發生同源重組(Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-106； Choulika等，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-73；Donoho等，Mol.Cell. Biol，1998，18，4070-8；Elliott等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-101；Sargent 等，Mol.Cell.Biol.，1997，17，267-77；Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 1996，93，5055-60；Chiurazzi等，Plant?Cell，1996，8，2057-2066)，這使得大 范圍核酸酶誘導的重組成為用于基因組工程的有效且有力的方法。大范 圍核酸酶誘導重組的應用長期以來受到天然大范圍核酸酶種類的限制， 當前技術的主要限制在于需要預先在目的基因座引入大范圍核酸酶切 割位點。

因此，人們對產生具有特定底物特異性的人工大范圍核酸酶進行了 深入地研究。這樣的蛋白質可用于切割真正的染色體序列，并開啟了基 因組工程在多種應用中的新前景。例如，大范圍核酸酶可用于誘導修正 與單基因遺傳病相關的突變，避免目前基因治療方法中使用的隨機插入 轉基因所導致的風險(Hacein-Bey-Abina等，Science，2003，302，415-419)。

最近，Cys2-His2型鋅指蛋白(ZFP)的鋅指DNA結合結構域可與 FokI核酸內切酶的催化結構域融合，從而誘導多種類型細胞(包括人 淋巴樣細胞)中的重組(Smith等，Nucleic?Acids?Res，1999，27，674-81； Pabo等，Annu.Rev.Biochem，2001，70，313-40；Porteus和Baltimore， Science，2003，300，763；Urnov等，Nature，2005，435，646-651；Bibikova等， Science，2003，300，764)。ZFP的結合特異性相對容易操作，目前得到了 一組能夠結合許多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的新的人工ZFP(Pabo等， 如前引用；Segal和Barbas，Curr.Opin.Biotechnol.，2001，12，632-7； Isalan等，Nat.Biotechnol.，2001，19，656-60)。但是，保持非常窄的底物 特異性是基因組工程應用的主要問題之一，目前尚不清楚ZFP是否滿 足治療應用極其嚴格的要求。另外，已證明這些融合蛋白質在細胞中具 有高毒性(Porteus和Baltimore，如前引用；Bibikova等，Genetics，2002， 161，1169-1175)，這可能是由于特異性水平低所致。

在自然界中，大范圍核酸酶基本上以歸巢核酸內切酶(homing endonuclease，HE)為代表，歸巢核酸內切酶是由可移動遺傳元件 (mobile?genetic?element)編碼的核酸內切酶家族，其功能是在被稱為 “歸巢”的過程中起始由DNA雙鏈斷裂(DSB)誘導的重組事件 (Chevalier和Stoddard，Nucleic?Acids?Res.，2001，29，3757-74； Kostriken等，Cell；1983，35，167-74；Jacquier和Dujon，Cell，1985，41， 383-94)。在細菌、真核生物和古細菌中已鑒定出數百種HE(Chevalier 和Stoddard，如前引用)；但是在所選基因中找到HE切割位點的可能 性是非常低的。