[發明專利]具有新切割特異性的I－CreI歸巢核酸內切酶變體及其用途

有效

• 申請號: 200680039556.5
• 申請日: 2006-10-03
• 公開（公告）號: CN101297032A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 弗雷德里克·帕克
• 申請（專利權）人: 賽萊克蒂斯公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉曉東;顧晉偉

1.一種改造出具有經修飾的切割特異性的I-CreI歸巢核酸內切酶變體 的方法，所述方法包括至少以下步驟：

(a)用選自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、 W和Y的氨基酸替換I-CreI中β₁β₂發夾的K28、Y33和/或S40中至少 一個氨基酸，

(b)選擇和/或篩選來自步驟(a)的能夠切割DNA靶序列的I-CreI變體， 所述靶序列由突變的I-CreI位點組成，其中至少-9位的a核苷酸和/或 +9位的t核苷酸被不同的核苷酸所替換。

2.一種改造出具有經修飾的切割特異性的I-CreI歸巢核酸內切酶變體 的方法，所述方法包括至少以下步驟：

(a)用選自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、 W和Y的氨基酸替換I-CreI中β₁β₂發夾的K28、N30、Y33、Q38和/或 S40中至少一個氨基酸，

(b)選擇和/或篩選來自步驟(a)的能夠切割DNA靶序列的I-CreI變體， 所述靶序列由突變的I-CreI位點組成，其中至少-8位的a核苷酸和/或 +8位的t核苷酸被不同的核苷酸所替換。

3.根據權利要求1或2的方法，其中步驟b)中的DNA靶標衍生自選 自SEQ?ID?NO：1至3的I-CreI位點。

4.根據權利要求1或2的方法，其中步驟b)中的DNA靶標包含具有 下式的序列：c_-11n_-10n_-9n_-8m_-7y_-6n_-5n_-4n_-3k_-2y_-1r₊₁m₊₂n₊₃n₊₄n₊₅r₊₆k₊₇n₊₈n₊₉n₊₁₀g₊₁₁，其中n是 a、t、c或g，m是a或c，y是c或t，k是g或t，r是a或g只要當n_-9n_-8是aa時，n₊₈n₊₉不是tt，并且當n₊₈n₊₉是tt時，n_-9n_-8不是aa即可。

5.根據權利要求4的方法，其中n_-5n_-4n_-3是gtc和/或n₊₃n₊₄n₊₅是gac。

6.根據權利要求1或2的方法，其中步驟b)中所述DNA靶標的-11到-8 位和+8到+11位的核苷酸序列和/或-5到-3位和/或+3到+5位的核苷酸序列 是回文的。

7.根據權利要求1或2的方法，其中步驟b)中的DNA靶標包含-9到-8 位的核苷酸二聯體和/或+8到+9位的核苷酸二聯體，所述-9到-8位的核苷 酸二聯體選自：ag，at，ac，ga，gg，gt，gc，ta，tg，tt，cg，ct或cc，所述+8到+9 位的核苷酸二聯體是-9到-8位所述核苷酸二聯體的反向互補序列。

8.根據權利要求1或2的方法，其中步驟b)中的DNA靶標還包括用不 同核苷酸替換I-CreI位點-10位的核苷酸a和/或+10位的核苷酸t。