[發明專利]通過特異的內切蛋白酶對帶有堿性氨基酸C－末端的多肽進行酰胺化的方法

無效

• 申請號: 200680034026.1
• 申請日: 2006-09-13
• 公開（公告）號: CN101268097A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: S·里佐姆;P·哈伯曼;C·薩拉尼亞德;F·措赫爾;L·蘭德里克－布爾泰因
• 申請（專利權）人: 塞諾菲－安萬特德國有限公司
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K14/605;C12P21/02;C12P21/06
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;隗永良

技術領域

本發明涉及用于制備C-末端酰胺化的二元肽或多元肽(di-orpolybasic?peptides)的方法，特別是用于制備那些具有人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)生物學活性的肽、或其類似物或衍生物的方法。

背景技術

與制藥相關的肽和蛋白質的穩定性、生物醫學利用度和作用持續性很大程度上依賴于其分子N-末端或C-末端的性質。生物分子的半衰期明顯受到帶有堿性氨基酸的C-末端延伸的影響。具體而言，如果在具有超過一個堿性氨基酸的C-末端延伸上，在C-末端結尾的氨基酸是氨基酰胺，那么能夠獲得良好的藥學活性。

這種基于肽的活性物質，如果該肽足夠小，可以按照改良的Merrifield合成方案直接全部通過化學合成進行制備。然而，當這種肽的需要量很大時，則顯現出該方法的局限性。因此，為了接下來在化學修飾后適于用作肽合成的反應物，必須先行制備并且純化在合成中將要用到的氨基酸。在除去合成結束時的保護性基團后，然后可將目的肽或產物純化，并配制為藥物。依賴于肽的組份，而且，通過在個別的偶聯步驟中錯誤的偶聯，在合成期間的鄰近效應可導致有限的產量、外消旋作用或副產品的形成，因此可能對總產量或者產品純度有不利影響。對于制備大量的所需產品，全合成太復雜。因此，通過可替代的方法，特別是生物工程的方法進行制備是令人期待的。

能夠使肽的C-末端酰胺化的酶是早已公知的。這些酶被命名(Eipper等人，Mol.Endocrinol.1987?Nov；1(11)：777)為肽酰甘氨酸α-酰胺化酶(PAM)。這種PAM酶的制備和純化是技術人員所熟悉的，并且已經有詳細的描述(M.Nogudi等人，Prot.Expr.Purif.?2003，28：293)。然而，與其它的工業酶例如胰蛋白酶或羧肽酶的制備相比，該制備是昂貴的。

當該酶與要被酰胺化的前體蛋白在同一宿主細胞中共表達時，出現了替代通過PAM“體外”酰胺化的方法。這是通過在宿主特異性的調控序列的控制下將編碼PAM活性的基因序列引入宿主細胞來完成的。這個表達序列可以是穩定摻入各個染色體DNA序列之中，或者是存在于與目的蛋白的表達質粒平行的第二個質粒上，或者是在同一個載體上整合作為第二個表達盒，或被克隆至與編碼目的蛋白的基因序列同相的多順反子表達通路中，置于同一啟動子序列的調控之下。然而，上述產量較低，所以只有通過相當大的發酵容量才能達到大量制備的目的。這導致純化復雜，更加昂貴。此外，該酰胺化不是定量發生的，以至于必須將已酰胺化的所需蛋白從未酰胺化的蛋白中分離出來。支持分泌性制備方法的決定(例如，Hong等人，Appl?Biochem?Biotechnol.2003；110，p.113-23)必須考慮到的事實是，具有多元C末端的蛋白質只有很少量的分泌或者根本不分泌。

用于酰胺化的另外的方法是基于應用蛋白特異性的自切割機制(Cottingham等人，Nature?Biotech.Vol.19，974-977，2001)。然而，控制這種反應并不容易，并且可能發生轉硫酯化和因而形成不需要的產物。融合蛋白可能相當大的程度上對產量有不利的影響。

上述酰胺化進程從目的肽的C末端開始，通過至少一個氨基酸甘氨酸或可替代的內蛋白肽延伸。然而，C末端為賴氨酸的肽，如果在序列中其后它們不包含另外的賴氨酸或精氨酸，可以按多聚體結構制備，該多聚體隨后可通過胰蛋白酶或類胰蛋白酶消化轉化為單體單元。以這種方式可獲得高的產量。而在前述方法中這是不可能的。

因此，已知的生物技術制備方法有不少缺點。制備在C末端具有超過一個堿性氨基酸的賴氨酸或精氨酸的肽或蛋白質，并且最后以合理的費用使其大量酰胺化，這個目標尚未滿意地解決。

如果能夠大量制備目的肽的前體，該肽被至少截短一個堿性氨基酸，并且隨后用賴氨酰胺或精氨酰胺以酶催化的半合成方式延長該前體，那么將出現另一種替代的制備方法。

Levin等(Biochemical?Journal?63：308-16；1956)描述了胰蛋白酶對賴氨酰胺和多種聚賴氨酰胺肽的作用。該作者的結果顯示賴氨酰胺衍生物在胰蛋白酶的影響下不能轉化為高分子量的賴氨酰胺衍生物，因為過渡類型的酰胺水解為游離酸比偶聯反應更快。因此得出結論：胰蛋白酶催化的半合成的方法，其提供C端-連接的聚賴氨酰胺或聚精氨酰胺或聚-賴氨酸/精氨酸混合序列的肽的制備，是不成功的或者僅成功獲得低產量。

發明內容