[發明專利]通過特異的內切蛋白酶對帶有堿性氨基酸C－末端的多肽進行酰胺化的方法

無效

• 申請號: 200680034026.1
• 申請日: 2006-09-13
• 公開（公告）號: CN101268097A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: S·里佐姆;P·哈伯曼;C·薩拉尼亞德;F·措赫爾;L·蘭德里克－布爾泰因
• 申請（專利權）人: 塞諾菲－安萬特德國有限公司
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K14/605;C12P21/02;C12P21/06
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;隗永良

1.?用于制備通式I的C-末端酰胺化的二元肽或多元肽的方法，所述通式I為

(AA)_n-X_m-NH₂(I)，

其中

(AA)_n是由n個相同或不同類型的氨基酸組成的肽，其中

AA是氨基酸或其類似物或衍生物；

n是3至2000之間的整數；并且

X是堿性氨基酸或其類似物或衍生物；

m是2至15之間的整數，

其中

通式II的化合物

(AA)_n-X_p????(II)

與通式III的化合物在具有胰蛋白酶生物學活性的酶的存在下反應

(X)_q-NH₂????(III)

其中AA、n和X被定義如上，以及

p和q是整數，以及

p+q＝m，

并且在合適條件下，對產生的通式I的化合物進行蛋白質化學純化。

2.?如在權利要求1中所要求的方法，其中m是2至10之間的整數。

3.?如在權利要求2中所要求的方法，其中m是2至6之間的整數。

4.?如在權利要求1-3中任意一項所要求的方法，其中n是10至1000之間的整數。

5.?如在權利要求1-4中任意一項所要求的方法，其中n是15至500之間的整數。

6.?如在權利要求1-5中任意一項所要求的方法，其中n是20至400之間的整數。

7.?如在權利要求1-6中任意一項所要求的方法，其中

a)表達融合肽，其包含一個或多個通式II的化合物作為融合肽的部分；

b)通過化學的或酶的切割從所述融合肽釋放通式II的化合物；

c)從步驟b得到的中間產物，在適當條件下經蛋白質化學純化后，在具有胰蛋白酶生物學活性的蛋白質存在下，與通式III的化合物反應；并且

d)在適當條件下，對產生的通式I的化合物進行蛋白質化學純化和分離。

8.?如在權利要求7中所要求的方法，其中通過氰鹵化物、腸激酶、凝血因子Xa、Genenase、凝血酶或胰蛋白酶從該融合蛋白中清除通式II的化合物。

9.?如在權利要求7中所要求的方法，其中在表達系統中表達融合蛋白，所述表達系統選自包含大腸桿菌、肉糖葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、螢光假單胞菌、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、啤酒裂殖酵母和釀酒酵母的組。

10.?如在權利要求1-2的一項或多項權利要求中所要求的制備通式I的C末端酰胺化的二元肽或多元肽的方法，其中所述通式I的肽具有GLP-1或其衍生物或類似物的生物學活性。

11.?如在權利要求1-10的任一項所要求的方法，其中通式I的化合物由通式IV表征：

HGEGTFTSDL?SKQMEEEAVR?LFIEWLKNGG?PSSGAPPS(X)_m-NH₂(IV)。

12.?如在權利要求1-11的任一項所要求的方法，其中通式I的化合物由以下序列表征：

HGEGTFTSDL?SKQMEEEAVR?LFIEWLKNGG?PSSGAPPSKKKKKK-NH₂(SEQ?ID?No.1)；

HGEGTFTSDL?SKQMEEEAVR?LFIEWLKNGG?PSSGAPPSKK-NH₂(SEQ?ID?No.2)；

HGEGTFTSDL?SKQMEEEAVR?LFIEWLKNGG?PSSGAPPSKR-NH₂(SEQ?ID?No.3)；

HGEGTFTSDL?SKQMEEEAVR?LFIEWLKNGG?PSSGAPPSKKKKKR-NH₂(SEQ?ID?No.4)或

HGEGTFTSDL?SKQMEEEAVR?LFIEWLKNGG?PSSGAPPSRK-NH₂(SEQ?ID?No.5)。