[發明專利]突變體擴環酶及其在β－內酰胺化合物生產中的用途

無效

• 申請號: 200680025577.1
• 申請日: 2006-04-10
• 公開（公告）號: CN101300360A
• 公開（公告）日: 2008-11-05
• 發明（設計）人: 迪克·希珀;理查德·克爾曼;羅拉納·麥德勒尼·拉姆斯多克;魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12P37/00
• 分類號: C12P37/00;C12N9/02
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 肖善強

本發明涉及突變體擴環酶、編碼這類酶的多核苷酸、用編碼所述突變 體擴環酶的所述多核苷酸轉化的微生物，和這類突變體擴環酶或這類微生 物在5-羧基戊酰基-6-氨基青霉烷酸(己二酰基-6-APA＝ad-6-APA)擴環中的 應用。

β-內酰胺類抗生素是具有很長臨床應用歷史的抗生素化合物的最重要 群體。在該群體中，突出的是青霉素類和頭孢菌素類。青霉素類通常由多 種絲狀真菌如Penicillium(例如P.chrysogenum)生產。頭孢菌素類天然 地由多種微生物如Acremonium(例如A.chrysogenum)和Streptomyces (例如Streptomyces?clavuligerus)產生。

作為經典菌株改良技術的結果，在過去數十年內P.chrysogenum和A. chrysogenum中抗生素的生產水平已顯著提高。隨著產生青霉素類和頭孢 菌素類的生物合成途徑知識的增長和重組DNA技術的來臨，已經能夠獲 得用于改良生產菌株的新工具。

已經鑒定了涉及β-內酰胺生物合成的大部分酶并克隆了它們相應的基 因，如可見于Ingolia?and?Queener，Med?Res?Rev(1989)9：245-264(生物合 成途徑和酶)和Aharonowitz，Cohen，and?Martin，Ann?Rev?Microbiol(1992) 46：461-495(基因克隆)。

P.chrysogenum中青霉素生物合成的前兩個步驟是將三個氨基酸L-5- 氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-纈氨酸(V)縮合 為三肽LLD-ACV，然后將該三肽環化形成異青霉素N。該化合物含有β- 內酰胺結構。

第三步涉及通過酰基轉移酶(AT)的作用用疏水側鏈取代L-5-氨基-5-羧 基戊酸的親水側鏈。

在EP-A-0448180中已描述由AT介導的酶交換反應發生在細胞器微體 中。觀察到表達脫乙酰氧基頭孢菌素C合酶(EC?1.14.20.1-DAOCS，在 本文還稱作擴環酶)的非前體P.chrysogenum轉化體可形成大量脫乙酰氧 基頭孢菌素C(DAOC)，這意味著P.chrysogenum中存在大量的青霉素N- -擴環酶的天然底物(Alvi?et?al.，J?Antibiot(1995)48：338-340)。然而， DAOC的D-α-氨基-己二酰基側鏈不容易被去除。

頭孢菌素比青霉素昂貴得多。一個原因是一些頭孢菌素(例如頭孢氨 芐)是通過大量化學轉化從青霉素制成的。另一個原因是迄今為止，只有 具有D-α-氨基-己二酰基側鏈的頭孢菌素可以被發酵。在該方面迄今為止 最重要的起始材料頭孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，從而意味著 要使用麻煩和昂貴的柱技術的費時和昂貴的分離方法。以此種方式獲得的 頭孢菌素C必需通過大量化學和酶轉化被轉化為治療中使用的頭孢菌素。

目前工業上偏好的用于制備中間體7-氨基-脫乙酰氧基頭孢菌烷酸(7- ADCA)的方法涉及復雜的化學步驟來實現青霉素G的擴環和衍生。產生 7-ADCA的必需化學步驟之一涉及將5元青霉素環結構擴環為6元頭孢菌 素環結構(參閱例如US?4,003,894)。該復雜的化學加工不但昂貴，而且 對環境有害。

因此，存在將這類化學方法用酶反應(如酶催化，優選地在發酵中) 代替的強烈需要。用生物學方法替換這些化學擴環方法的關鍵在于頭孢菌 素生物合成途徑中的中心酶——擴環酶。

已發現來自細菌Streptomyces?clavuligerus(S.clavuligerus)的擴環酶在 一些情況下進行青霉素環的擴環。被引入P.chrysogenum后，其可將青霉 素環結構轉化為頭孢菌素環結構，如Cantwell?et?al.，Proc?R?Soc?Lond?B (1992)248：283-289中所述。擴環酶已被在生物化學和功能上充分表征(EP- A-0366354)，其相應基因也是如此。CefE基因(編碼S.clavuligerus擴環 酶的基因-EP-A-0341892)的物理圖譜、DNA序列和P.chrysogenum中 用cefE轉化的研究均已被描述。S.clavuligerus擴環酶的DNA和氨基酸序 列顯示于SEQ?ID?NO?1。