[發明專利]合成的基因調控區

無效

• 申請號: 200680021029.1
• 申請日: 2006-06-09
• 公開（公告）號: CN101198617A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發明（設計）人: M·庫爾茨;J·布賴恩;M·K·布朗洛;L·舒爾茨;M·C·洛薩達;K·揚森
• 申請（專利權）人: 默克公司
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C12N1/19
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 程淼;黃可峻

相關申請的交叉引用

本申請要求2005年6月14日提交的美國臨時申請序號為60/690,321的優先權，此處通過引入的方式而引用。

發明背景

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)或面包酵母廣泛用作用于各種異源多肽表達的宿主。來自多種物種的許多不同蛋白質已經在釀酒酵母中被表達，有的至水平＞總細胞蛋白質的10％。表達通常通過質粒調節，該質粒包含編碼異源多肽的DNA序列和釀酒酵母中調控基因表達的基因調控區，以及在釀酒酵母和大腸桿菌中篩選和擴增該質粒所需的其他序列。作為選擇，也可以將所述編碼序列和基因的調控區整合入釀酒酵母的染色體并實現高水平表達。

用于釀酒酵母中異源多肽的表達的基因調控區通常是天然存在于釀酒酵母中的那些基因調控區，例如，用于表達反向的GAL1和GAL10基因的基因調控區。相反，當異源基因調控區用于釀酒酵母細胞時，通常已經發現其是無活性的，或產生異常的轉錄起始。因而已提出使用釀酒酵母的基因調控區對于釀酒酵母細胞中異源基因的有效表達是必不可少的(Romanos等，YEAST?8：423-488(1992))。

此處引用的參考文獻不被允許作為所要求的發明的現有技術。

發明概述

本發明涉及一種合成的基因調控區，所述合成的基因調控區包括：包含酵母菌株的基因調控蛋白的結合位點的合成的基因調控序列，和位于所述合成的基因調控序列下游的來自絲狀真菌菌株的啟動子。所述絲狀真菌啟動子能夠被酵母菌株的通用轉錄因子和RNA聚合酶識別。所述合成的基因調控序列能夠調節由所述酵母菌株中的絲狀真菌啟動子引發的轉錄。所述基因激活子的結合位點優選合成的結合位點。

根據本發明的一個實施方式，所述酵母菌株選自由釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia?pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)和Yarrowia?lipolytica組成的組。根據本發明的一個優選實施方式，所述酵母菌株是釀酒酵母。根據本發明的一個替代性實施方式，所述酵母菌株是巴斯德畢赤氏酵母。

所述絲狀真菌菌株可選自由玉米黑粉菌(Ustilago?maydis)、構巢曲霉(Aspergillus?nidulans)和Penicillium?purpurogenum組成的組。所述絲狀真菌啟動子可選自由玉米黑粉菌DPM1基因的啟動子、構巢曲霉ArgB基因的啟動子和Penicillium?purpurogenum?XynA基因的啟動子組成的組。

根據本發明的一個實施方式，所述結合位點是用于酵母菌株的基因激活子。根據本發明的一個優選實施方式，所述結合位點是釀酒酵母的GAL4蛋白的結合位點。根據本發明的其他優選實施方式，所述結合位點包含選自由SEQID?NO：10、11、12和15組成的組的序列，合成的GAL4結合位點。

所述基因調控序列還可包含酵母菌株的基因阻遏子的結合位點。根據本發明的一個實施方式，所述基因阻遏子的結合位點是釀酒酵母的MIG1蛋白的結合位點。根據本發明的一個優選實施方式，MIG1蛋白的結合位點包含選自由SEQ?ID?NO：18、19和20組成的組的序列。

根據本發明的一個優選實施方式，所述合成的基因調控區可包含選自由SEQ?ID?NO：21、22、23、24、25和26組成的組的序列。

本發明提供DNA表達載體，所述載體包含所述合成的基因調控區、在所述調控區的控制下編碼蛋白質、多肽或肽的編碼序列和酵母選擇標記物。所述編碼序列可編碼真核生物、原核生物或病毒的氨基酸序列。如果所述酵母菌株是釀酒酵母，所述選擇標記物可選自由LEU2、TRP1、URA3和HIS3組成的組。

所述DNA表達載體還可以包含位于編碼序列下游的聚腺苷酸化信號序列。該DNA表達載體還可包含位于編碼序列下游的轉錄終止子。該DNA表達載體還可包含酵母復制起點，例如基于釀酒酵母2μm?DNA序列(2?micronDNA?sequence)的復制起點。該DNA表達載體還可包含細菌復制起點。

本發明進一步提供包含所述DNA表達載體的酵母菌株。所述酵母菌株可選自由釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia?pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)和Yarrowia?lipolytica組成的組。