[發(fā)明專利]蛋白糖基化

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680020096.1
• 申請日: 2006-04-06
• 公開（公告）號: CN101198619A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 本杰明·居伊·戴維斯
• 申請（專利權(quán)）人: ISIS創(chuàng)新有限公司
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107
• 代理公司: 中原信達知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司
• 代理人: 楊青;樊衛(wèi)民

發(fā)明領域

本申請涉及蛋白糖基化的方法和利用這些方法制備的糖基化蛋白。

發(fā)明背景

蛋白在翻譯過程中和翻譯過程后的糖基化在它們的生物學性能和穩(wěn)定性方面起著重要作用(R.Dwek，Chem.Rev.，96：683-720(1996))。例如，糖基化在重要的生物過程比如細胞信號傳遞和調(diào)節(jié)、發(fā)育和免疫中起著重要作用。這些事件的研究因以下事實而非常困難：自然界的糖蛋白以稱為糖型的混合物形式存在，它們具有相同肽骨架，但在糖基化性質(zhì)和位點方面不同。此外，因為蛋白糖基化不是直接受遺傳控制，治療性糖蛋白在哺乳動物細胞培養(yǎng)中的表達導致非均勻糖型的混合物。因此合成均質(zhì)糖蛋白糖型的能力不僅是達到準確研究目的的先決條件，而且在制備治療性糖蛋白時其重要性越來越高，當前市場上的所述治療糖蛋白為多糖型混合物(例如紅細胞生成素和白介素)。因此控制蛋白糖基化的程度和性質(zhì)可以使在生物系統(tǒng)中研究和控制其性能變成可能。

蛋白糖基化的大量方法是公知的，包括化學合成。糖蛋白的化學合成具有某些優(yōu)點，至少具有得到純糖蛋白糖型的可能性。一種已知的合成方法利用硫醇選擇性的糖類試劑，糖基甲磺酰硫代(糖基-MTS)。這種糖基甲磺酰硫代試劑與蛋白的硫醇基反應，通過二硫鍵引入與蛋白連接的糖基殘基。

Cu(I)催化的三唑形成已經(jīng)用于大量的標記研究(Link等人，J.Am.Chem.Soc.125：11164-11165?2003；Link等人，J.Am.Chem.Soc.126：10598-10602?2004；和Speers等人，Chemistry?and?Biology?11：535-5462004)以及在合成中(Tornoe等人，J.Org.Chem.67(9)：3057-3064?2002)。這種反應吸引人的特征在于疊氮基與炔基反應的高選擇性，以及在存在各種其他官能團的含水條件下進行反應的能力。

最近文獻(Kuijpers等人，Org.Lett.6(18)：3123-3126?2004)已經(jīng)證明從合適地官能團保護的糖類和保護的氨基酸/肽合成三唑連接的糖基氨基酸和小的糖肽。此外還有其他類型三唑連接的糖結(jié)合物的報道(Chittaboina等人，Tetrahedron?Lett.46：2331-2336?2005)，其利用保護的糖類衍生物進行合成。

Lin和Walsh修飾了一種10個氨基酸的環(huán)肽，N-乙酰半胱胺硫酯(SNAC)將炔官能團引入肽中。該方法涉及在肽的不同位置用非天然氨基酸類似物，炔丙基甘氨酸，取代肽的氨基酸(Van?Hest?et?al，J.Am.Chem.Soc.122：1282-1288(2000)和Kiick等人，Tetrahedron56：9487-9493(2000))。然后修飾的肽與疊氮基糖結(jié)合產(chǎn)生糖基化的環(huán)肽。

需要一種比在現(xiàn)有技術描述的更簡化的方法，例如不需要使用保護的糖基化試劑，用于更復雜結(jié)構(gòu)例如蛋白的糖基化，并且可以在大范圍不同蛋白的多個位點進行糖基化。

發(fā)明描述

根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供一種修飾蛋白的方法，所述方法包括修飾蛋白以包括至少炔基和/或疊氮基。

在此處使用時，“疊氮”基團是指(N＝N＝N)，“炔”基團是指碳碳三鍵。

蛋白修飾通常涉及用一個或多個包括炔基和/或疊氮基的氨基酸類似物取代蛋白中的一個或多個氨基酸。此外，或者除以上所述之外，蛋白修飾可以包括如此處討論在蛋白中引入一個或多個天然氨基酸。在另一個選擇中，蛋白修飾可以涉及氨基酸側(cè)鏈的修飾以包括化學基團，例如硫醇基。蛋白的修飾以包括疊氮基、炔基或者硫醇基，通常發(fā)生在蛋白氨基酸序列內(nèi)部預先確定的位置。

在本發(fā)明的優(yōu)選方面，蛋白修飾涉及用一個或多個非天然(即非天然存在的)氨基酸類似物取代蛋白的一個或多個氨基酸。非天然氨基酸類似物可以是甲硫氨酸類似物。甲硫氨酸類似物可以是高炔丙基甘氨酸(Hpg)(Van?Hest等人，J.Am.Chem.Soc，122，1282-1288(2000))，高烯丙基甘氨酸(Hag)(Van?Hest等人，F(xiàn)EBS?Letters，428，68-70(1998))和/或疊氮基高丙氨酸(Aha)(Kiick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，19-24(2002)，優(yōu)選高炔丙基甘氨酸。