[發明專利]用于純化抗體的方法

有效

• 申請號: 200680017966.X
• 申請日: 2006-05-23
• 公開（公告）號: CN101180317A
• 公開（公告）日: 2008-05-14
• 發明（設計）人: R·法爾肯施泰因;B·科爾布;M·西博爾德
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼－拉羅切有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;G01N30/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;凌立

技術領域

本發明涉及多肽純化領域。本文描述了使用離子交換樹脂純化免疫球蛋白的新方法。本文同時提供了快速確定純化條件的方法。

背景技術

蛋白質，尤其是免疫球蛋白在當今的醫學領域中起著重要作用。對于人的應用，每一種藥物必須滿足獨特的標準。為確保生物藥劑對人的安全性，尤其要除去可導致嚴重傷害的核酸、病毒和宿主細胞蛋白質。為滿足質量管理規格標準，必須在生產過程之后進行一個或多個純化步驟。其中，純度、生產量和產率在確定合適的純化方法中起著重要作用。

已良好地建立不同的方法并且已將其廣泛地用于蛋白質的純化，例如使用微生物蛋白質的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式的交換)、親硫吸附(例如使用β-巰基乙醇和其他SH配體)、疏水性相互作用或芳香族化合物吸附層析(例如使用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)、大小排阻層析和電泳方法(例如凝膠電脈、毛細管電泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

Necina，R.等人，Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698，報導了通過表現為高電荷密度的離子交換介質從細胞培養物上清液直接捕獲人單克隆抗體。在WO?89/05157中，報導了通過直接對細胞培養基進行陽離子交換處理純化產物免疫球蛋白的方法。Danielsson，A.等人，J.Immun.Meth.115(1988)，79-88描述了從小鼠腹水一步純化單克隆IgG抗體的方法。

Raweerith，R.等人(J.Immun.Meth.282(2003)63-72)使用方法的組合，即，辛酸沉淀法(caprylic?acid?precipitation)和離子交換層析的組合作為分級分離胃蛋白酶消化的馬抗蛇毒素F(ab′)₂抗體的方法。在WO2003/102132中報導了用于純化蛋白質的非親和純化步驟和高效切向流過濾的組合。在WO?92/19973中報導了兩種親和層析步驟的組合。

Follman，D.K.和Fahrner，R.L.報導了使用無A蛋白的三個層析步驟的抗體純化方法的析因篩選(factorial?screening)(J.Chrom.A?1024(2004)79-85)。Mhatre，R.等人(J.Chrom.A?707(1995)225-231)探究了使用陽離子交換層析和pH梯度洗脫對抗體Fab片段進行純化。

WO?94/00561報導了人單克隆抗獼猴抗體和產生該抗體的細胞系。在WO?2004/024866中報導了通過離子交換層析純化多肽的方法，在所述方法中，使用梯度洗滌從一種或多種污染物中分離出目的多肽。Schwarz，A.等人(Laborpraxis?21(1997)62-66)報導了使用CM-HyperD-柱對單克隆抗體的純化。

WO?2004/076485報導了使用A蛋白和離子交換層析進行抗體純化的方法。在EP?0?530?447中報導了通過組合三個層析步驟純化IgG單克隆抗體的方法。在US?4,983,722中報導了從抗體制品中除去A蛋白。

WO?95/16037報導了通過A蛋白陽離子交換層析進行的從雜種雜交瘤純化抗EGF-R/抗-CD3雙特異性單克隆抗體。在EP?1?084?136中報導了通過使用離子交換層析從抗體多聚體分離其單體。US?5,429,746涉及使用疏水作用層析組合層析純化抗體分子蛋白質。

發明概述

因此本發明的目的是提供用于純化重組產生的免疫球蛋白和用于分離單體和多聚體免疫球蛋白種類的另一種方法。

本發明提供了用于純化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括下列步驟：

a)提供包含免疫球蛋白、緩沖物質和任選的鹽的溶液；

b)在免疫球蛋白借以與弱離子交換材料結合的條件下，使溶液和該弱離子交換材料接觸；

c)通過使用包含緩沖物質和鹽的溶液，以單步驟從弱離子交換材料回收免疫球蛋白。

本發明還提供了用于確定在單步驟純化方法中從離子交換層析材料洗脫多肽的鹽濃度的方法，其包括下列兩個步驟：

a)步驟1包括下列亞步驟：

a1)提供包含多肽、緩沖物質和任選的鹽的溶液；