[發(fā)明專利]新型療法和篩選治療化合物的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680015384.8
• 申請日: 2006-05-03
• 公開（公告）號: CN101194163A
• 公開（公告）日: 2008-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: C·斯文伯格;L·古斯特夫森
• 申請（專利權(quán)）人: 尼亞哈姆雷特藥品公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 程淼;梁謀

本發(fā)明涉及篩選化合物的方法，用以評價該化合物殺死細胞的能力，具體而言是腫瘤細胞以及細菌細胞或病毒感染細胞，同樣涉及用于治療的殺死細胞的新型試劑，例如用于腫瘤的治療。

HAMLET(人α-乳清蛋白制成的腫瘤細胞致死因子)(Humanα-lactalbumin?made?lethal?to?tumor?cells)是一種分子復合物，其誘導腫瘤細胞的細胞死亡。實際上，這種作用對于腫瘤細胞和一些未成熟細胞是選擇性的，而健康的分化細胞并不響應HAMLET而經(jīng)受細胞死亡。這種選擇性意味著HAMLET觸及到腫瘤細胞中的獨特靶標，而在耐受細胞中則未觸及。

如本文所使用的，術(shù)語″HAMLET″指α-乳清蛋白的生物學活性復合物(其可以是或者可以不是人類來源的)，其可以通過從在pH4.6下被沉淀下來的乳的酪蛋白級分中分離，通過例如在EP-A-0776214中所述的陰離子交換色譜和凝膠色譜的組合而獲得，或者通過在存在來自人乳酪蛋白的輔因子，如WO99/26979中所述的表征為C18:1脂肪酸的情況下將α-乳清蛋白經(jīng)離子交換色譜而獲得。具有相似活性的這種復合物的生物學活性變體或衍生物在例如國際專利申請?zhí)朠CT/IB03/01293中被加以描述。

HAMLET在許多不同的體外腫瘤細胞系中引發(fā)凋亡樣死亡(apoptosis-like?death)。白血病細胞最為敏感，而癌、黑素瘤和膠質(zhì)母細胞瘤細胞系均死于HAMLET，并伴有凋亡樣特征。成熟的分化細胞對于HAMLET是耐受的，如其存活力以及完好的細胞形態(tài)所顯示，而胚細胞則表現(xiàn)為部分響應。HAMLET廣泛的抗腫瘤活性是似非而是的(paradoxical)，因為腫瘤細胞通常對于指導正常細胞死亡的凋亡信號是耐受的。腫瘤細胞攜帶著突變，該突變打亂了傳統(tǒng)凋亡是涉及的主要信號通路，包括p53和bcl-2基因家族，而HAMLET的作用獨立于這些通路，表明HAMLET復合物具有鑒別基本的細胞死亡程序的能力，該細胞死亡程序在腫瘤細胞中保持活躍，而在成熟的分化細胞中則失去了。近來，已表明HAMLET在人大鼠膠質(zhì)母細胞瘤異體移植物模型中同樣在體內(nèi)引發(fā)了選擇性腫瘤細胞凋亡，并且表明在安慰劑對照臨床研究中HAMLET局部應用于皮膚乳頭瘤上能夠減少或消除損害。

HAMLET的細胞靶標已通過共聚焦顯微術(shù)與亞細胞分級的組合而被檢測[Hakansson?et?al.，1999?Exp?Cell?Res.246，451-60]。HAMLET結(jié)合于細胞表面，并進入細胞質(zhì)，在那里它與線粒體相互作用并使其活化。最終，此蛋白質(zhì)進入細胞核，在其中積聚。

申請人已發(fā)現(xiàn)耐受細胞和敏感細胞以相似的效率將HAMLET結(jié)合于其表面，表明這并不是產(chǎn)生差異的事件。相反，細胞核內(nèi)的積聚僅在瀕死細胞中發(fā)生，表明此步驟將敏感細胞與耐受細胞區(qū)分開。通過共聚焦顯微術(shù)，細胞核積聚似乎是不可逆的，表明存在細胞核靶標，其在細胞核隔室內(nèi)結(jié)合并保留了HAMLET。

申請人已對HAMLET的細胞核內(nèi)分布進行了更加細致的檢測，并已發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)優(yōu)先定位于核仁對應的區(qū)域，意味著HAMLET與涉及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的分子相互作用。

作為進一步研究的結(jié)果，HAMLET的核靶標被加以鑒定。令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)HAMLET與特異性組蛋白以及與核小體相互作用。因此，似乎這種相互作用可能是將細胞不可逆地鎖入死亡通路的事件。

不過，目前進一步的機制呈現(xiàn)了其自身，其被認為是產(chǎn)生了進一步的篩選方法，該方法將導致進一步的治療劑和治療機會。

本發(fā)明提供了一種篩選用于殺死細胞的測試物質(zhì)的方法，所述方法包括使測試物質(zhì)與蛋白酶體接觸，并檢測它們之間導致蛋白酶體結(jié)構(gòu)變化的相互作用。

為滿足測試的要求，該測試物質(zhì)應當能夠與蛋白酶體(有時被稱為蛋白體)以產(chǎn)生蛋白酶體結(jié)構(gòu)改變的方式相互作用。一般而言，這些變化將包括蛋白酶體的片段化(fragmentation)。此類差異通過溫育后檢測蛋白酶體的結(jié)構(gòu)而被適當?shù)丶右源_定。

一般使用常規(guī)的凝膠分離法進行此種類型的結(jié)構(gòu)檢測。指示條帶尺寸變化的任何的條帶顯著位移、或者新條帶的形成都預示該測試物質(zhì)已與蛋白酶體以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性變化的方式相互作用。