[發(fā)明專利]核糖體展示方法或mRNA展示方法以及對蛋白質改進的穩(wěn)定性進行的選擇

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680007212.6
• 申請日: 2006-01-05
• 公開（公告）號: CN101180393A
• 公開（公告）日: 2008-05-14
• 發(fā)明（設計）人: 安德魯·布坎南;盧茨·杰姆圖斯
• 申請（專利權）人: 劍橋抗體技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 閔丹;巫肖南

本發(fā)明涉及選出、獲得或制備穩(wěn)定性改進的多肽變體的方法。本發(fā)明還涉及所述變體在選擇后的制備和用途，例如在治療中的用途。

本發(fā)明利用展示技術，結合體外翻譯，以及在RNA之類的基因型和目標多肽之類的編碼表型之間的共價連接或非共價連接(non-covalentlinkage)，來選出比親本多肽穩(wěn)定性改進且保持功能活性的多肽變體。

核糖體或多核糖體(polysome)展示和選擇涉及構建核酸文庫，篩選結合，鑒定出目標結合實體。通過合成多樣化序列的DNA庫，將該庫轉錄產生mRNA庫，制得所述文庫。體外翻譯用于產生需要展示的編碼多肽或蛋白，所需的結合用固相靶抗原選出。編碼所述結合實體的mRNA可用于制備cDNA并將該cDNA擴增，可以重復該過程，使編碼結合物的基因數大增。隨后，可以克隆各個編碼序列并進行DNA測序，從而鑒定出所選蛋白。

所述技術已有多方面的綜述(Hanes等，(2000)Meth.Enzymol.328，403-430；Plückthun等，(2000)Adv.Prot.Chem.55，367-403；Lipovsek和Plückthun(2004)J.Immunological?Methods?290，51-67)。

該技術已用于展示抗體片段、肽和各種蛋白，包括周質蛋白和胞質蛋白，如β-內酰胺酶和錨蛋白-重復蛋白。

從多核糖體復合體中回收mRNA首先報道于1973年的論文中，該論文描述了利用抗體和固定的寡胸苷來捕獲編碼小鼠免疫球蛋白L鏈的mRNA的方案(Schechter(1973)PNAS?USA?70，2256-2260)。Payvar和Schimke對多核糖體免疫沉定反應方案進行了改進(Eur.J.Biochem.(1979)101，271-282)，在利用單克隆抗體對多核糖體進行免疫沉淀后，獲得了HLA-DR抗原的重鏈cDNA克隆(PNAS?USA(1982)79，1844-1848)。Kawasaki提出并取得了利用核糖體展示來制備抗體文庫的專利(美國專利號5,643,768和美國專利號5,658,754，EP-B-0494955)。

已有多個利用真核或原核翻譯體系進行核糖體展示的應用實例。利用大腸桿菌提取物選擇肽配體是由Mattheakis等首個論證的(PNAS?USA(1994)91，9022-9026和Methods?Enzymol(1996)267，195-207)。該小組利用給定抗體作為選擇底物，證實選出了與給定抗體的已知肽表位很相似的肽配體。結合前列腺特異性抗原的高親和力肽配體，利用小麥胚芽(wheat?germ)提取物翻譯體系，從肽文庫經多核糖體篩選而鑒定出(Gersuk等，(1997)Biotechand?Biophys.Res.Com.232，578-582)。有報道稱，原設計用于增加三元復合體(ternary?complex)產量、且允許形成二硫鍵的大腸桿菌翻譯體系，被用來篩選功能性抗體片段(Hanes和Pluckthun，PNAS?USA(1997)94，4937-4942)。該實驗計劃隨后被用于從鼠文庫中篩選抗體，結果表明，因PCR誤差和篩選的組合效力，致使篩選期間發(fā)生了親和成熟。獲得了一種解離常數約為10^-11M的ScFv片段(Hanes等，PNAS?USA(1998)95，14130-50)。還有人利用兔網織紅細胞裂解物的提取物，從混合抗體群富集特異性抗體(He和Taussig(1997)NAR，5132-5234)。

mRNA展示與核糖體展示一樣，利用mRNA與所編碼的多肽之間的復合體作為基本篩選單元。mRNA展示不同于核糖體展示之處是，mRNA與蛋白之間連接的共價特性。這種連接通過小銜接分子實現，所述分子通常是嘌呤霉素(Nemoto等，(1997)FEBS?Lett?414：405；Roberts和Szostak，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA?94：12297；Takahashi等，(2003)Trends?Biochem.Sci.28：159)。mRNA展示并不限于4℃，而這是核糖體展示的常用溫度。通常，篩選所用溫度受蛋白靶標穩(wěn)定性的限制。已有人用mRNA展示對肽和抗體進行親和篩選(參見Lipovsek和Plückthun，(2004)J?Immunological?Methods290：51-97)。