[發(fā)明專利]核糖體展示方法或mRNA展示方法以及對蛋白質(zhì)改進的穩(wěn)定性進行的選擇

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680007212.6
• 申請日: 2006-01-05
• 公開（公告）號: CN101180393A
• 公開（公告）日: 2008-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 安德魯·布坎南;盧茨·杰姆圖斯
• 申請（專利權(quán)）人: 劍橋抗體技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所
• 代理人: 閔丹;巫肖南

1.一種提供比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進的目標(biāo)多肽變體的方法，該方法包括：

(a)提供多個mRNA分子，每一mRNA分子包含編碼目標(biāo)多肽變體的核苷酸序列且缺失框內(nèi)終止密碼子；

(b)保溫所述mRNA分子，所用的保溫條件致使所述mRNA分子發(fā)生核糖體翻譯，產(chǎn)生所編碼的目標(biāo)多肽變體，由此形成多個復(fù)合體，每個復(fù)合體都至少含有mRNA和所編碼的目標(biāo)多肽變體；

(c)將這些復(fù)合體與結(jié)合所述親本目標(biāo)多肽的受體、配體或特異性結(jié)合配對物接觸，選出一個或多個復(fù)合體，它們每一個都在該選擇條件下展示出與所述受體、配體或特異性結(jié)合配對物結(jié)合的目標(biāo)多肽變體；

其中，如下進行步驟(i)，(ii)和(iii)中的一步或多步；

(i)在步驟(b)的翻譯過程中，同時使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力；

(ii)在步驟(c)的選擇過程中，同時使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力；

(iii)至少一種穩(wěn)定性選擇壓力在步驟(b)的翻譯過程中、繼而在步驟(c)的選擇過程中使用，且至少一種另外的穩(wěn)定性選擇壓力在步驟(c)的選擇過程中使用；和

(d)確定所選的一或多種目標(biāo)多肽變體的穩(wěn)定性，從而獲得比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進的一種或多種目標(biāo)多肽變體。

2.權(quán)利要求1的方法，其中形成了復(fù)合體，所述復(fù)合體包含mRNA、編碼的目標(biāo)多肽變體和核糖體。

3.前述任一權(quán)利要求的方法，其中穩(wěn)定性選擇壓力選自下組：二硫蘇糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl)，伴侶分子耗竭，pH，小分子蛋白折疊抑制劑，蛋白酶，硫氰酸鈉，疏水相互作用層析(HIC)和溫度。

4.前述任一權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)中的穩(wěn)定性選擇壓力選自下組：二硫蘇糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl)，伴侶分子耗竭，pH和小分子蛋白折疊抑制劑。

5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中在步驟(c)的選擇過程中使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力。

6.前述任一權(quán)利要求的方法，其中步驟(c)中的穩(wěn)定性選擇壓力選自下組：二硫蘇糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl)，蛋白酶，硫氰酸鈉，HIC和溫度。

7.前述任一權(quán)利要求的方法，其中二硫蘇糖醇(DTT)在步驟(b)中用作穩(wěn)定性選擇壓力。

8.前述任一權(quán)利要求的方法，其中HIC和/或溫度在步驟(c)中用作穩(wěn)定性選擇壓力。

9.權(quán)利要求1的方法，其中DTT在步驟(b)中用作穩(wěn)定性選擇壓力，HIC和溫度在步驟(c)中用作穩(wěn)定性選擇壓力。

10.權(quán)利要求8或9的方法，其中溫度是室溫。

11.前述任一權(quán)利要求的方法，其中，通過比較所選一或多種目標(biāo)多肽變體在有和無DTT的條件下被展示出來時，對受體、配體或特異性結(jié)合配對物的結(jié)合能力，測出穩(wěn)定性。

12.權(quán)利要求1-10之一的方法，其中穩(wěn)定性是通過將所選的一或多種目標(biāo)多肽變體的聚集與親本目標(biāo)多肽的聚集進行比較而測出的。

13.前述任一權(quán)利要求的方法，其中在翻譯體系中保溫的mRNA分子是通過RT-PCR反應(yīng)獲得的，在該PCR中至少一種RT-PCR引物是誘變引物，其編碼包含在編碼目標(biāo)多肽變體的核苷酸序列的指定區(qū)域內(nèi)的多種不同序列。

14.前述任一權(quán)利要求的方法，還包括從所選復(fù)合體中回收mRNA。

15.權(quán)利要求14的方法，其中對從展示所選目標(biāo)多肽變體的所選復(fù)合體中回收的mRNA進行擴增，并將其拷貝到編碼該所選目標(biāo)多肽變體的DNA中。

16.權(quán)利要求15的方法，其中所述DNA是在用于制備產(chǎn)物的表達體系中提供的，所述產(chǎn)物是所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈。

17.權(quán)利要求16的方法，還包括分離或純化所述產(chǎn)物。

18.權(quán)利要求17的方法，還包括將所述產(chǎn)物配制成含有至少一種其它組分的組合物。