[發明專利]有機化合物

無效

• 申請號: 200680006844.0
• 申請日: 2006-03-01
• 公開（公告）號: CN101133325A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發明（設計）人: M·奧爾;N－C·梅斯納;M·欣特施泰納;T·申德勒;H·格斯塔奇
• 申請（專利權）人: 諾瓦提斯公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/542
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;隗永良

發明領域

本發明涉及有機化合物，并且涉及用于鑒定調節mRNA與靶蛋白質如ELAVL1蛋白之間相互作用的物質的測定法。

技術背景

大量基因的表達在信使RNA水平上受到控制。特別地，與某些刺激具有疾病相關性的早期應答基因從而是多種靶標的快速應答通常因轉錄后控制機制而得以促進。這些過程主要由對信使RNA起作用的調控蛋白質或因子介導。抑制或調節這類調控性靶mRNA-蛋白質的相互作用代表了有吸引力的治療性干預手段。

為了尋找抑制mRNA調控的低分子量抑制劑，需要一種監測靶向mRNA-蛋白相互作用的測定法，理想地是在均質溶液中進行。所述測定法應還適合于在高通量篩選(HTS)環境中實施，高通量篩選目前大部分通常基于熒光檢測。

相對小的蛋白質，如mRNA穩定蛋白質HuR(36kD)，與長mRNA或亞片段(281-1643個核苷酸，100-500kD)的直接結合，不能基于大小的相對增加來檢測，因為熒光標記的RNA在復合物形成時衰減。有鑒于此，可以容易地排除基于轉動或平移擴散時間檢測的光譜法(例如熒光相關光譜(FCS)、2D-FIDA-各向異性或其他熒光偏振測量法)。

本發明的測定法代表了一種在真正平衡條件下監測均質溶液中的mRNA-蛋白質相互作用的新方法。例如該法應用高度敏感的單分子檢測法，由此直接適合于HTS平臺如Evotec?MarkII/III。由于所述檢測如共焦檢測具有高靈敏度和精確度，所以本發明的測定法代表了有吸引力的不同于常規電泳遷移率變動分析、濾膜結合試驗或核酸酶保護分析的可選方案。適應常規的宏觀熒光強度檢測方法(例如熒光板讀出器)也將是直截了當的，并不一定需要利用共焦儀器。

發明內容

本發明一方面提供了用于鑒定調節mRNA與靶蛋白質之間相互作用的物質的測定法，所述測定法包括：

a)提供長度至少為100個核苷酸的標記的mRNA，任選作為均質溶液提供，所述的標記為對mRNA環境中的改變敏感的物質；

b)在不存在和存在候選化合物的情況下使靶蛋白質如HuR與步驟a)中提供的mRNA接觸，所述候選化合物預期將在所述mRNA與所述靶蛋白質如HuR之間能夠形成復合物的足夠長的時間內調節所述mRNA與所述靶蛋白質如HuR之間的相互作用；

c)檢測步驟b)中形成的復合物；

d)測定在步驟b)中不存在或存在候選化合物的情況下所形成的復合物的量是否存在差異；和

e)將在步驟d)中測定到差異的候選化合物選為鑒定物質。

測定原理可以說明如下(例如，如圖1中所示)：標記mRNA，例如，通過肼醛連接化學在3’末端用Cy3標記。一旦靶蛋白質結合至標記的mRNA，則所述標記如Cy3的量子產率改變，例如增加，并且這種改變提供了mRNA與靶蛋白質相互作用的讀出值。這一效應顯然不涉及蛋白質與標記的直接接觸，而且，甚至對于靶蛋白質(如HuR)結合位點遠離其3’端標記的mRNA而言，也可觀察到再現性。目前我們推斷這一結果可能是因為與靶蛋白質形成復合物時，RNA三維構象改變，通過長程效應發生平移所致，并且歸因于標記如Cy3的環境敏感性(例如，參見Mujumdar?R.B等，Bioconj?Chem.1993，4(2)105-11)。因潛在抑制劑所致的蛋白質-mRNA復合物形成的減少將檢測為讀出值如總熒光強度的下降，或具有更高分子亮度的物質顆粒數量的減少。

在優選的實施方案中，靶蛋白質為HuR蛋白。

mRNA可以為含ARE的mRNA，并且包括：例如炎性靶標，包括來自TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、Cox-2、IL-4或AT-R1的ARE，而且包括其他ARE調控的靶標家族。例如，原癌基因，如c-myc、c-jun或c-fos。

在本發明的另一方面，mRNA選自編碼IL-2、IL-1β和TNF-α的序列，或這類序列含ARE的片段。

在本發明的另一方面，mRNA具有100-500個核苷酸，優選300個核苷酸的長度。

標記可以為常規的，例如生物素或酶，如堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)或過氧化物酶(POD)或熒光分子，例如熒光染料。優選標記為熒光染料，例如Cy3或Cy5，例如Cy3。

在本發明的優選的一方面，標記為熒光標記，例如Cy3或Cy5。

靶蛋白質可以為已知結合mRNA的任何蛋白質，其中這類結合導致RNA三維構象改變。在本發明的另一方面，靶蛋白質為結合含ARE的mRNA的ELAVL1(＝HuR)。