[發(fā)明專利]細(xì)胞透化和穩(wěn)定試劑及其使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200680004090.5
• 申請日: 2006-01-24
• 公開（公告）號: CN101115388A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 恩里克·拉貝利諾;安德烈亞斯·范阿格托萬;法布里斯·馬萊格
• 申請（專利權(quán)）人: 貝克曼考爾特公司
• 主分類號: A01N37/18
• 分類號: A01N37/18;A61K38/00
• 代理公司: 上海市華誠律師事務(wù)所
• 代理人: 傅強(qiáng)國

技術(shù)領(lǐng)域

[001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞透化和穩(wěn)定試劑及其用于制備含有細(xì)胞的樣品以分析細(xì)胞組分 的使用方法。

背景技術(shù)

[002]在分子水平上分析細(xì)胞內(nèi)部組分是人們的迫切要求。最近出現(xiàn)了數(shù)種探針和抗體， 其通常可用于常規(guī)研究并且指示胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。這些探針和抗體，因?yàn)樗鼈兊拇蠓肿犹匦允蛊浔? 身不能通過細(xì)胞膜滲入細(xì)胞。因此需要對細(xì)胞進(jìn)行處理，以便使細(xì)胞膜變得可滲透(透化級)。 這種處理會造成外部類脂膜的重大改性，并且取決于所使用的方法，可以導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的喪 失，或者甚至導(dǎo)致整個細(xì)胞的死亡。

[003]標(biāo)準(zhǔn)的透化方法包括在顯微鏡載玻片上或者在懸浮液中，通過在低溫(-20℃)下用 醇稀釋來處理細(xì)胞。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于分子結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)靶抗原保存得很好。但除步驟復(fù)雜并 且使用低溫之外，在處理的末尾，細(xì)胞形態(tài)基本上被改變了。

[004]有幾種透化方法使用了細(xì)胞固定術(shù)，其使用脂族醛對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾，這會導(dǎo) 致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚集。通過用醇或表面活性劑處理，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞透化。脂族醛固定術(shù)因?yàn)? 透化后細(xì)胞的形態(tài)保存優(yōu)良而特別為人所知。然而，從蛋白質(zhì)分子水平上講，許多抗原位點(diǎn) 被固定方法破壞。

[005]在有機(jī)溶劑、醇類、弱堿和弱酸組成的組中通常會找到用于使細(xì)胞滲透化的試劑。 這些試劑使細(xì)胞膜透化，然而它們通常不能使細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定化。

[006]因此人們渴望有一種用于細(xì)胞透化的試劑，其會在透化后仍能保護(hù)細(xì)胞的形態(tài)，并 且不會改變細(xì)胞內(nèi)外的抗原位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

[007]在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞透化和穩(wěn)定試劑，其包括N-酰 基肌氨酸或其由下述分子結(jié)構(gòu)式表示的鹽：R₁-CO-N(CH₃)CH₂COOX₁，其中R₁是具有8～18 碳原子的烷基或亞烷基團(tuán)，而X₁是H、Na⁺或K⁺；pH調(diào)節(jié)劑，將所述試劑的pH調(diào)節(jié)至小于 7；以及一種水介質(zhì)。該試劑具有低離子強(qiáng)度，這由其電導(dǎo)率小于9.0mS/cm所確定。優(yōu)選 N-酰基肌氨酸是N-月桂酰肌氨酸或其鹽，試劑的pH范圍是大約4～6，并且電導(dǎo)率小于1.2 mS/cm。

[008]優(yōu)選該透化和穩(wěn)定試劑進(jìn)一步包括牛血清白蛋白和甘油，以增強(qiáng)細(xì)胞膜的滲透性， 并且使表面活性劑穩(wěn)定化。

[009]任意地，該透化和穩(wěn)定試劑可以進(jìn)一步包含由下述分子結(jié)構(gòu)式表示的陰離子表面活 性劑：R₂-O-SO₃X₂；其中R₂是具有8～18碳原子的烷基或亞烷基團(tuán)；而X₂是Na⁺、K⁺、NH₄⁺或NH₂C(CH₂OH)₃。陰離子表面活性劑優(yōu)選三(十二烷基)硫酸鹽。

[010]在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的目的在于提供一種滲透過細(xì)胞膜并且保留細(xì)胞的細(xì) 胞組分以用于流式細(xì)胞術(shù)分析的方法。該方法包括如下步驟：使含有細(xì)胞的樣品與細(xì)胞透化 和穩(wěn)定試劑混合以形成樣品混合物；樣品混合物孵育足夠的時間以便滲透過細(xì)胞膜；促使胞 內(nèi)蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜內(nèi)聚集，同時保留細(xì)胞組分用于與細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合；將細(xì)胞標(biāo)記物加入樣 品混合物，并且將樣品混合物再孵育一段時間，以使得細(xì)胞標(biāo)記物與被保留的細(xì)胞組分相結(jié) 合。該方法可以進(jìn)一步包括，在將細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合于在樣品混合物中的細(xì)胞組分之后固定細(xì) 胞。可以在流式細(xì)胞儀上通過光散射和熒光分析來分析該樣品混合物。

附圖說明

[011]圖1顯示了pH和表面活性劑的使用對于血液不同組分中蛋白質(zhì)的沉淀影響：頂部左 側(cè)，血清；頂部右側(cè)，牛血清白蛋白；底部左側(cè)，可溶性細(xì)胞組分；底部右側(cè)，細(xì)胞膜組分。

[012]圖2A至2J顯示了pH和表面活性劑的使用對紅血球保存和透化的影響。

[013]圖3A至3J顯示了pH和表面活性劑的使用對白血球保存和透化的影響。

[014]圖4A至4F顯示了通過使用胎兒血紅蛋白抗原(HbF)和i檢測血液中F細(xì)胞和胎細(xì) 胞的結(jié)果。