[發(fā)明專利]使用正義單鏈病毒RNA載體在植物中生產(chǎn)抗體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200680003264.6
• 申請(qǐng)日: 2006-01-27
• 公開（公告）號(hào): CN101115842A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·吉里奇;S·馬里約內(nèi);V·克利姆克;Y·格萊巴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 愛康遺傳有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/67;C12N15/63
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所
• 代理人: 黃革生;隗永良

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用正義單鏈RNA病毒載體在植物、植物部分或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生異源寡聚蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的方法和載體為植物細(xì)胞提供產(chǎn)量提高的功能性異源寡聚重組蛋白，例如全長(zhǎng)的抗體或其異源寡聚合成衍生物(包括與其它蛋白質(zhì)或其片段的融合)。

背景技術(shù)

基于植物的分子農(nóng)業(yè)是產(chǎn)生設(shè)計(jì)用于人類和動(dòng)物健康領(lǐng)域的重組蛋白的良機(jī)，由于其潛在的低生產(chǎn)成本以及生物制藥工業(yè)為從制造方法中消除動(dòng)物衍生蛋白質(zhì)的嘗試(因?yàn)檫@些產(chǎn)品可能受到人抗原，例如牛海綿狀腦炎(BSE)或克雅病(CJD，vCJD)污染)而成為優(yōu)選。然而，使用基于強(qiáng)組成型或組織特異性啟動(dòng)子的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)系統(tǒng)不能解決在植物細(xì)胞中高產(chǎn)量生產(chǎn)異源寡聚蛋白質(zhì)的問題，原因如下：首先，大部分這樣的重組蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育具有不利的影響，因此嚴(yán)重影響產(chǎn)量；其次，使用組織特異性啟動(dòng)子(例如種子特異性)需要將編碼藥物蛋白質(zhì)的基因穩(wěn)定摻入可食用作物植物(例如稻、玉米、小麥)的基因組，這在開放領(lǐng)域栽培情況下可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因流控制的問題。此外，如果出于產(chǎn)物的低產(chǎn)量而在封閉(溫室)環(huán)境中使用，這些系統(tǒng)是不可商購(gòu)的。

基于植物病毒的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(見綜述：Porta和Lomonossoff，1996，Mol.Biotechnol.，5，209-221；Yusibov等人，1999，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，240.81-94；Gleba等人，2004，Curr.Opin.Plant?Biol.，7，182-188)能夠在植物葉組織中提供高表達(dá)水平并且在一定程度上能夠處理重組蛋白質(zhì)的毒性及其對(duì)植物發(fā)育的有害影響的問題，因?yàn)樵摷夹g(shù)能夠使生長(zhǎng)和生產(chǎn)期分離。最佳已建立的和可商購(gòu)的系統(tǒng)是基于正義單鏈RNA病毒載體，優(yōu)選基于煙草花葉病毒(TMV)衍生的載體(Kumagai等人，1994，Proc.Natl.Acad.ScL?USA，90，427-430；Mallory等人，2002，Nature?Biotechnol.20，622-625；US5316931；US5589367；US5866785；US5977438；WO02088369；WO02097080；WO0229068；US5491076)。然而，這些系統(tǒng)受到嚴(yán)重的局限，限制其用于產(chǎn)生簡(jiǎn)單、相對(duì)小的蛋白質(zhì)。這部分是由于病毒載體的不穩(wěn)定及其高頻率的回復(fù)成為野生型(如果其帶有大于1kb的異源序列)而引起。該技術(shù)的另一嚴(yán)重的局限是缺乏能夠表達(dá)代表最有價(jià)值的重組蛋白類的復(fù)合異源寡聚蛋白質(zhì)(例如治療的單克隆抗體及其衍生物)的病毒載體系統(tǒng)。

僅有一份公開提出使用植物病毒載體在植物中表達(dá)全長(zhǎng)的單克隆抗體(Verch等人，1998，J.Immunol.Meth.，220，69-75)。該文獻(xiàn)描述了使用兩個(gè)系統(tǒng)的基于TMV的病毒載體在體系的葉中表達(dá)單克隆抗體的重鏈和輕鏈，通過使用所述載體的體外合成的轉(zhuǎn)錄本共轉(zhuǎn)染本氏煙草(N.benthamiana)植物，從不同載體表達(dá)不同的鏈。然而，重組蛋白在所述系統(tǒng)中的產(chǎn)量很低，以至于必須使用高度靈敏的測(cè)試，例如Western印跡和ELISA確定裝配的單克隆抗體的存在。由于重組抗體的微不足道的產(chǎn)量，該系統(tǒng)不適于實(shí)際應(yīng)用并且不具有商業(yè)價(jià)值。因?yàn)閮蓚€(gè)或多個(gè)基于TMV的病毒載體通常不存在于被轉(zhuǎn)染植物的相同植物組織中(見實(shí)施例1)，檢測(cè)的抗原結(jié)合活性可能歸因于在分離操作中來(lái)自不同細(xì)胞或組織中表達(dá)的抗體重鏈和輕鏈的體外裝配。先前已表明功能性的抗體可以由變性和還原的抗體組分體外裝配(Petersen和Dorrington，1974，J.Biol.Chem.，17，5633-5641；Maeda等人，1996，Protein?Engineering，9，95-100)。然而，在缺乏這樣裝配的適宜條件下，這樣的裝配的效率極低。

因此，對(duì)于重組的異源寡聚蛋白質(zhì)，在植物中沒有其產(chǎn)量和效率足以與其它大規(guī)模表達(dá)系統(tǒng)(例如真菌或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的大規(guī)模表達(dá)系統(tǒng)。這樣的植物表達(dá)必須盡可能好地滿足下列標(biāo)準(zhǔn)：

(i)高產(chǎn)量，包括在盡可能多的植物組織中和所述組織的盡可能多的細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)異源寡聚蛋白質(zhì)；

(ii)為了避免重組蛋白表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)的有害影響，蛋白質(zhì)或目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)應(yīng)該為瞬時(shí)(或可轉(zhuǎn)換的)從而能夠在期望的植物發(fā)育階段開始表達(dá)；