[發明專利]誘變方法

有效

• 申請號: 200680002045.6
• 申請日: 2006-01-09
• 公開（公告）號: CN101103110A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: R·R·明特;S·G·萊恩;R·G·E·霍爾蓋特;M·A·T·格羅韋斯
• 申請（專利權）人: 劍橋抗體技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

[001]本發明涉及產生誘變的核酸分子的方法。特別地，本發明涉及這樣的方法中，在該方法中，誘變反應中使用的引物(誘變引物)本身是從模板核酸分子合成的。誘變反應的產物是誘變的環狀核酸分子，其能例如在不需要其它修飾的情況下，被轉化進入細菌。在優選的實施方式中，本方法被運用于分子群，例如用于分子群的產生和篩選中。本方法也以組合方式被使用，在其中，多種誘變引物用于突變多種親代分子。

[002]涉及分子生物學技術的其中一個步驟是引導核酸分子進入載體。例如，DNA片段或DNA片段群可以被消化，并通過連接反應被引入載體。例如，DNA片段(或片段群)可從第一個載體(例如，質粒)消化并除去，利用已知的亞克隆方法進入第二個載體。這樣，第一載體使用和第二載體相同的限制性內切酶進行消化，以致生成用于連接的互補的突出端。然后，DNA片段和第二載體依靠其互補的突出端進行連接，結果得到包含所述DNA片段的完整的載體，其能在宿主細胞中(例如，在細菌中)復制。

[003]因此，可以產生大量的DNA以用于多種分子生物學應用。或者，已引入DNA的載體可具有特定的目的(例如可以是表達載體)。一旦被引入這樣的表達載體，限制性片段編碼的蛋白質可從宿主細胞中的載體表達。一旦表達，所產生的蛋白能被純化以用于其最終用途。或者具體地，當本方法用來將DNA片段群引入表達載體時，表達的蛋白可用于篩選(例如，通過對靶分子的結合親和力)。

[004]引導突變進入DNA的多種方法也是已知的。從Barik的研究中已知，用基于PCR的方法引導突變進入線性DNA(Barik，Methods?in?Molecular?Biology?Vol.192：PCR?Cloning?Protocols，2^nd?edition?p189-196，Eds?B-Y?Chen?and?H.?W?Janes?@Humana?Press?Inc，Totowa，NJ?Burke?and?Barik，Methods?in?Molecular?Biology?Vo.226：PCR?Protocols，2nd?Edition?p?525-531，Eds?JMS?Bartless?and?D?Stirling?@Humana?Press?Inc，Totowa，NJ)。依照這些方法，在PCR反應中所謂的大引物(megaprimer)已被用于引導突變進入線性模板。然而，這些方法導致線性雙鏈DNA產物，為了產生用于例如放大(scale?up)或者用于蛋白質表達的復制型，這些產物本身必需被亞克隆入適當的載體。

[005]Miyazaki提出了一種涉及全質粒PCR的方法(Miyazaki，Methods?inMolecular?Biology：Directed?Evolution?Library?Creation：Methods?and?Protocols.EdsArnold?and?Georgiou，Humana?Press?Inc.Totowa，NJ；BioTechniques?33：1033-1038)。在這種方法中，雙鏈質粒在PCR反應中被用作模板，并將包含將被引入的突變的雙鏈PCR產物加入到該PCR反應用于引發PCR反應。然而，引物和模板的雙鏈性能引起引物鏈和模板鏈自退火而不是交叉退火，因此使用特定的引物與模板比率以使自退火現象最小化。

[006]除了由雙鏈模板導致的自退火的問題以外，當雙鏈模板用于PCR反應時，還有進一步的問題。在指數反應中，當在一輪中引入的錯配在指數基礎上被攜帶入隨后的每一輪中時，引入錯配的容量是巨大的。而且，這里PCR模板是大模板例如載體，諸如質粒，這進一步增加了引入錯配的可能性。

[007]使用合成的寡核苷酸去突變DNA也是已知的(Kunkel?et?al.，(1985)PNAS?USA，Vol?82，pp?488-492；Sidhu?et?al.，Phage?Display for?the?Selection?of?NovelBinding?Peptides)。但是，能被化學合成的寡核苷酸的長度是有限制的。另外，為了使合成儀程序化，序列必須是已知的并且預先輸入到合成儀中以用于其產生。

[008]因此需要可選的誘變方法。特別地，需要產生能直接被轉化入細菌的產物的方法，準備用于下游，例如用于表達篩選中(避免需要另外的消化和連接步驟來將核酸引入恰當的載體)。也需要快速、有效的誘變方法以及可經改良用于擴增的方法，例如用于產生篩選或產生文庫的群。