[發明專利]誘變方法

有效

• 申請號: 200680002045.6
• 申請日: 2006-01-09
• 公開（公告）號: CN101103110A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: R·R·明特;S·G·萊恩;R·G·E·霍爾蓋特;M·A·T·格羅韋斯
• 申請（專利權）人: 劍橋抗體技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

1.一種將一個或多個突變引入核酸分子的方法，所述方法包括下列步驟：

(a)從模板核酸分子合成誘變引物，其中所述誘變引物包含相對于親代分子的一個或多個突變；

(b)分離所述誘變引物的單鏈形式；

(c)將所述單鏈誘變引物與所述親代分子的單鏈形式退火；以及

(d)從所述誘變引物合成互補鏈，以產生包含所述突變的環形核酸分子。

2.根據權利要求1所述的方法，其中在所述退火步驟(c)之前，所述單鏈引物被與所述單鏈親代分子混合。

3.權利要求1所述的方法，其中步驟(b)的所述單鏈引物利用分離介質進行分離。

4.根據權利要求2所述的方法，在步驟(c)之前，進一步包括分離所述單鏈親代分子的步驟。

5.根據權利要求4所述的方法，在步驟(c)之前，進一步包括對所述單鏈親代分子施行的尺寸排阻步驟。

6.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述單鏈親代分子是單鏈環狀DNA。

7.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述親代分子是表達載體或噬菌體展示載體。

8.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述環形分子是共價閉合的環狀DNA。

9.根據前述任意一項權利要求所述的方法，進一步包括將所述誘變的核酸分子轉化入宿主細胞的步驟。

10.根據權利要求9所述的方法，其中所述轉化使用電穿孔施行。

11.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其包括在包含突變的所述互補鏈被優先選擇的條件下施行的步驟。

12.權利要求11所述的方法，其中所述互補鏈的優先選擇由所述親代分子的優先消化所致。

13.權利要求11所述的方法，其中所述親代分子包含修飾，這樣所述互補鏈被優先選擇。

14.權利要求13所述的方法，進一步包含引入所述修飾的步驟。

15.權利要求13或權利要求14所述的方法，其中所述修飾是引入dU代替dT。

16.權利要求13或權利要求14所述的方法，其中修飾是甲基化作用或者引入條件致死基因。

17.權利要求11到16任意一項所述的方法，其中所述優先選擇通過將來自步驟(d)的所述環形分子轉化入宿主細胞來施行，所述宿主細胞對互補的未修飾鏈具有選擇性。

18.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述誘變引物通過基于PCR的方法所合成。

19.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述誘變引物通過這樣的合成方法所合成，在該合成方法中，當從第一條鏈合成第二條鏈時，錯配被引入。

20.根據權利要求19所述的方法，其中所述方法是易錯PCR。

21.根據權利要求19或權利要求20所述的方法，其中用于所述誘變引物合成的模板的序列與在所述親代分子中找到的序列相同。

22.根據權利要求3所述的方法，其中合成所述誘變引物的步驟將結合部分引入所述誘變引物的正鏈或負鏈，并且所述分離是通過將所述結合部分結合至所述分離介質上的其結合配偶體而進行的。

23.根據權利要求22所述的方法，其中所述結合部分被引入所述誘變引物的正鏈，并且所述誘變引物的負鏈被從所述分離介質中洗脫。

24.根據權利要求22或權利要求23所述的方法，其中所述結合部分是生物素，并且所述結合配偶體是鏈霉親和素。

25.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述突變包括取代。

26.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述突變包括缺失。

27.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述突變包括添加。

28.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述突變是多個核苷酸的突變。