[發明專利]一種用于促進分枝桿菌生長的結核分枝桿菌Rv1009蛋白及其應用

有效

• 申請號: 200610171552.4
• 申請日: 2006-12-30
• 公開（公告）號: CN101210045A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 吳雪瓊;陽幼榮;李洪敏;韓躍松;李邦印;張俊仙;梁艷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三○九醫院
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/09;C12N15/31;C12N1/21
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 耿小強

1.一種用于促進分枝桿菌生長的結核分枝桿菌Rv1009蛋白。

2.如權利要求1所述的用于促進分枝桿菌生長的結核分枝桿菌Rv1009蛋白的氨基酸序列如下：

MLRLVVGALLLVLAFAGGYAVAACKTVTLTVDGTAMRVTTMKSR

VIDIVEENGFSVDDRDDLYPAAGVQVHDADTIVLRRSRPLQISLDGHDAK

QVWTTASTVDEALAQLAMTDTAPAAASRASRVPLSGMALPVVSAKTVQ

LNDGGLVRTVHLPAPNVAGLLSAAGVPLLQSDHVVPAATAPIVEGMQIQ

VTRNRIKKVTERLPLPPNARRVEDPEMNMSREVVEDPGVPGTQDVTFAV

AEVNGVETGRLPVANVVVTPAHEAVVRVGTKPGTEVPPVIDGSIWDAIA

GCEAGGNWAINTGNGYYGGVQFDQGTWEANGGLRYAPRADLATREQIA

VAEVTRLRQGWGAWPVCAARAG。

3.如權利要求2所述的用于促進分枝桿菌生長的結核分枝桿菌Rv1009蛋白的制備方法，其步驟如下：

(1)通過基因工程技術制備Rv1009蛋白：

(a)、引物設計與合成

上游引物5′-CATATGTTGCGCCTGGTAGTCGGTGC-3′

下游引物5’-GAATTCCCCGCTCGTGCAGCACATACCG-3′

擴增片段：1088bp

(b)、PCR擴增Rv1009基因

用上下游引物，在Taq?plus?I?DNA聚合酶的作用下，以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴增Rv1009基因。PCR反應程序：95℃5min；94℃1min，68℃1min，72℃2min，循環30次；最后72℃延伸7min。于1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定1088bp的擴增DNA片段；

(c)、回收目的基因片段：

瓊脂糖凝膠電泳結束后，在長波紫外線照射下，用干凈的手術刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書回收目的基因片段；

(d)、目的基因與pGEM-T載體連接：

將純化后PCR產物(50ng)與克隆載體pGEM-T連接，目的基因片段與載體片斷按摩爾比3∶1混合，10ul反應體系如下：

2×連接緩沖液???5μl

pGEM-T載體??????1μl

PCR產物?????????0.6μl

T₄DNA連接酶?????1μl

無菌水?補至?????10μl

混勻后置于4℃冰箱反應12h，75℃滅活10min，冰浴后直接進行轉化；

(e).大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞的制備：

挑取大腸桿菌DH5α(或BL21)單菌落接種于5ml?LB培養液中，置37℃振蕩培養箱中于200rpm培養過夜；次晨按1/100轉種于100ml?LB培養液中，置37℃振蕩培養箱中于200rpm繼續培養2-3h，待菌濃度OD₆₀₀為0.6～0.8時，放入用冰預冷的大離心管中，4℃、4000rpm、離心10min，棄上清液；20ml冰預冷的0.1mol/LCaCl2重懸菌沉淀，冰浴30min；于4℃、6000rpm、離心10min，棄上清液；用4ml?0.1mol/L?CaCl2重懸菌沉淀，置4℃冰箱放置過夜；次晨加入1ml無菌甘油，吹打混合均勻，每100μl分裝于一個1.5ml的離心管中，置-70℃保存備用；

(f).連接產物的轉化：

將目的基因片段與PGEM-T的連接產物各5μl分別加入含有100μl大腸桿菌DH5α感受態細胞的離心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培養液400μl，37℃恒溫搖床培養1h；加入X-Gal?60μl，IPTG?4μl，混勻，取出200-400μl涂布于含有60ug/ml氨芐青霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒溫培養箱培育14h；

(g).質粒的提取：

根據藍白斑篩選，隨機挑取白色菌落6個，分別接種于5ml含有60μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜；根據《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質粒；

①質粒小量提取試劑的配制

溶液I：50mmol/L葡萄糖

25mmol/L?Tris·CL(pH8.0)

10mmol/L?EDTA(pH8.0)

在10lbf/in²(6.895×10⁴Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲存于4℃備用；

溶液II：0.2mmol/L?NaOH，1％SDS臨用前配制

溶液III：5mol/L乙酸鉀???60ml

冰乙酸??????????????????11.5ml

去離子水????????????????28.5ml

貯存于4℃，備用；

②小量提取質粒

分別取約3.0ml菌液置離心管中，于12,000rpm離心1min，棄上清液；細菌沉淀重懸于200μl溶液I中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液II，冰浴5min；加300μl溶液III，冰浴10min；于4℃12,000rpm離心10min；上清液移入干凈的離心管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍體積的無水乙醇充分混合，于-20℃放置2h沉淀DNA；于4℃12,000rpm離心10min，棄上清液；用1ml?70％乙醇洗滌沉淀一次，室溫充分干燥；將沉淀溶于20μl?TE緩沖液中，加入無DNA酶的胰RNA酶，使其終濃度為20μg/ml，于37℃水浴30min，消化RNA；取2μl進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測、定量，置-20℃儲存備用；

(h).鑒定重組質粒：

①PCR擴增鑒定：以挑選的菌落質粒DNA為模板，以P1、P4引物進行PCR擴增鑒定。擴增產物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，陽性重組質粒命名為PGEM-Rv1009；

②酶切鑒定：取重組質粒5μl，分別用限制性內切酶Nde?I、EcoRI雙酶切2h；于1％瓊脂糖凝膠中電泳。以DNA分子量標準及擴增產物為對照，酶切后產生兩個片段，一個與載體片斷大小一致，一個與該基因擴增片斷一致；

③序列測定：直接挑選一個克隆送測序，測序結果與報道的基因組序列一致；

(i).重組表達質粒的構建：

用限制性內切酶Nde?I、EcoRI雙酶切pGEM-Rv1009重組質粒DNA和表達載體pET24b質粒DNA，于1％瓊脂糖凝膠電泳，切取1088bp的Rv1009基因片段和5265bp的pET24b質粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，Rv1009基因片段與pET24b質粒DNA片段按2∶1的摩爾比混合，在T₄DNA連接酶催化下，于16℃連接過夜，次日取連接產物5μl轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，置37℃恒溫箱孵育14h；挑選5個克隆分別轉種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養液中，置37℃恒溫振蕩器培養過夜，用堿裂解法提取質粒；

(j).重組表達質粒的鑒定

分別用牙簽隨機調取6個克隆，提取質粒，采用PCR擴增和雙酶切鑒定方法挑選重組子；鑒定正確的陽性克隆命名為pET24b-Rv1009；

(k)、pET24b-Rv1009工程菌的誘導表達及鑒定

將pET24b-Rv1009質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆轉種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養液中，置37℃恒溫振蕩器培養過夜，然后按1％轉種到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養液中，置37℃恒溫振蕩器培養至OD₆₀₀為0.6-0.8時，加入IPTG，誘導3-4hr；

將1×載樣緩沖液150μl加入來自1ml菌液的沉淀樣本，混懸后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm離心10min，取上清液40μl進行SDS-PAGE，電泳條件為：積層膠恒流10mA，分離膠恒壓15mA，待溴酚藍電泳至凝膠底部，停止電泳；用考馬斯亮藍R250染色液染色6h；用脫色液脫色至條帶清晰；與對照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-Rv1009-BL21(DE3)菌體在相對分子質量40kDa位置附近有濃重的表達條帶出現，誘導3-4小時表達量最多；

(l).Rv1009重組蛋白的純化

將誘導菌超聲破碎后，采用Novagen公司生產的His.Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒說明書在變性條件下純化Rv1009蛋白，SDS-PAGE電泳可見純化的Rv1009蛋白呈一條帶，未見其他雜蛋白；

(2)Rv1009蛋白制劑的制備和貯存

①稀釋液(0.5M氯化鈉-20mM磷酸氫二鈉-2％甘露醇，pH?7.4)的配制：稱取29.22g氯化鈉、7.1628g磷酸氫二鈉于700ml蒸餾水中，加入20g甘露醇，在磁力攪拌器上攪拌，加入鹽酸調節pH值至7.4，加雙蒸餾水定容至1000ml；

②用稀釋液稀釋所述的結核分枝桿菌重組Rv1009蛋白，使其濃度為1mg/ml；

③混勻后除菌濾過，分裝入一容器，1ml/支，冷凍干燥，置4℃避光保存備用。