[發明專利]一種檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙及其制備方法

無效

• 申請號: 200610167771.5
• 申請日: 2006-12-21
• 公開（公告）號: CN101206224A
• 公開（公告）日: 2008-06-25
• 發明（設計）人: 王景林;王俊虹;康琳;高姍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: G01N33/549
• 分類號: G01N33/549;G01N33/577;G01N33/532
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• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及一種蓖麻毒素的檢測試紙及其制備方法。

背景技術：

蓖麻毒素(Ricin?toxin，RT)是一種從蓖麻種子的胚乳中提取的植物蛋白毒素，分子量約為64kDa，兩條多肽鏈分別稱為RTA鏈(Ricin?toxin?A，RTA)和RTB鏈(Ricin?toxin?B，RTB)。RTA是活性鏈，分子量約為32?kDa。RTB是結合鏈，分子量約為34?kDa，兩者間由二硫鍵連接。由于蓖麻毒素來源廣泛，毒性較高，已被外軍作為武器化的一種毒素加以研究，禁止化學和生物武器公約把蓖麻毒素列為最為嚴格的控制對象之一。尤其是自美國“9.11”恐怖襲擊后，隨著多個恐怖組織和極端分子研制、擁有并攜帶蓖麻毒素驚現英國首都倫敦，使這種致命的毒素成為最有可能被用作恐怖襲擊的生物毒素。

由于氣溶膠化的蓖麻毒素微粒無色無味，不易被發現，因此偵檢非常困難。歷史上最初是用動物實驗測定蓖麻毒素的毒性和定量檢測。現階段則根據蓖麻毒素所具有的理化特性、生化特性和免疫原性發展出多種檢測法，其中以免疫檢測法為主^[1]。

免疫檢測法多是依賴于抗原抗體反應的免疫學方法，包括多克隆和(或)單克隆抗體為基礎的放射免疫法或酶聯免疫吸附法(ELISA)，免疫層析試驗和電化學發光生物傳感器，其中ELISA法是國際規定的檢測蓖麻毒素的金標準。但是，不同的檢測方法檢測蓖麻毒素的敏感性有差別。其中，免疫熒光技術(FIA)的靈敏度為4～20pg/mL，放射免疫技術(RIA)為0.006pmol，ELISA法則可檢測至100pg/mL^[2-3]。

另外，與傳感器技術相結合，現已開發用于偵檢和鑒定蓖麻毒素和其他生物毒素的生物傳感器，如電化學發光傳感器(ECL)和光纖生物傳感器，靈敏度均在ng-fg水平。其中，美國所研制的生物傳感器始終處于世界領先的地位^[4-8]。目前尚未發現利用免疫膠體金技術制備的免疫層析試紙檢測蓖麻毒素的報道。

發明內容：

本發明的目的是提供一種檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙。

本發明所提供的檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊的包被有抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上的含有抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫金膠體探針的金標墊和緊密連接于所述金標墊的樣品墊。

為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板，背板的材料優選的是塑料。

本發明的另一個目的是提供制備上述檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙的方法。本發明所提供的制備檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟：

1.制備抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體，選取一株抗蓖麻毒素A鏈蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株免疫雌性Balb/C小鼠，一周后取腹水；將該抗體溶液噴到纖維膜上，室溫晾干，然后將其粘貼在吸水紙墊上。

2.制備抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體：肌肉注射重組蓖麻毒素B鏈蛋白0.2mg+等體積福氏完全佐劑，一周后1mg蛋白+等體積福氏不完全佐劑加強免疫，4周后加強免疫蛋白1mg，3天后抽血。

3.制備抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫金膠體探針：

(1)將0.01％HAuCl₄水溶液，加熱煮沸，每100ml?HAuCl₄溶液進行如下操作：攪動下加入1.5ml的1％檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；

(2)確定最低偶聯抗體濃度：調節膠體金溶液pH9.0，將抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體稀釋2mg/mL，并依次加入到1ml膠體金溶液中100μl、90μl、80μl、70μl、60μl、50μl、40μl、30μl、20μl、10μl、0μl，混勻后于室溫下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混勻，靜置，10-20min后觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，為穩定1ml膠體金溶液所需最低偶聯抗體量；

(3)將終濃度為0.08mg/mL上述最低偶聯抗體量的抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體加入到50ml膠體金溶液中，混勻后得到抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫膠體金探針溶液。

4.將玻璃纖維膜或樹脂浸泡到上述免疫膠體金探針溶液，得到金標墊，干燥后粘貼在步驟1得到的粘貼在吸水紙墊上的噴有抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體的纖維膜上；

5.在步驟4中的金標墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙。

為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。