[發明專利]優化的小片段RNA載體系統及其構建方法

有效

• 申請號: 200610166613.8
• 申請日: 2006-12-31
• 公開（公告）號: CN101210253A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 李超;封江南;黃俊;黃映雪;孫永林;張云;康德嬌;嚴俊
• 申請（專利權）人: 國營武昌造船廠
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C07H21/02
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 樊戎;夏惠忠

技術領域

本實用新型涉及生物技術，特別涉及RNA干擾，尤其涉及一種RNA干擾用的優化(優化指為實現有益效果所進行的各項改造)型小片段RNA(100個bp以內的RNA)的載體系統及其構建方法。

背景技術

RNA一度被認為僅僅是DNA和蛋白質之間的“過渡”，但越來越多的證據清楚的表明，RNA在生命的進程中扮演的角色遠比我們早前設想的更為重要。

RNA干擾(RNA?interference)的發現使得人們對RNA調控基因表達的功能有了全新的認識。RNA干擾技術1998年被發現，2001年5月被成功用于哺乳動物細胞，開始了RNA干擾技術的廣泛應用。RNA干擾技術是利用雙鏈小片段RNA對目的基因進行封閉，達到干擾目的基因的作用。RNA干擾是生命最為古老的基因免疫監視機制。生命維持健康、抗御病毒侵入、抗腫瘤發生以及維持遺傳穩定等等都可能是依靠RNA干擾實現的，所以，對RNA干擾的研究和RNA干擾技術的應用受到空前的矚目。RNA干擾技術成功應用當年(2001年)就排在納米技術之后被評為世界十大技術進步的第二位。2002年又被評為十大技術進步的第一位。

RNA技術正在飛速發展，2001年5月第一次哺乳動物細胞應用RNAi時是采用的化學合成的雙鏈RNA，一年后推出了生物轉錄合成的雙鏈RNA，2003年以后越來越多的人開始使用質粒載體表達的雙鏈RNA。但目前質粒載體存在著許多的技術缺陷及難點。當前主流的小片段RNA表達載體的構建方案中為了實現目的小片段RNA的模板DNA的在啟動子3’端轉錄起始位點的準確插入大多是將啟動子3’的部分堿基進行突變以引入一個酶切位點。此外，由于該模板DNA通常僅為六十個堿基左右，這為重組載體的酶切鑒定帶來了困難，如在未經酶切鑒定的情況下直接進行DNA序列測定，過高的非重組率則會導致實驗周期過長和經費的耗費。為了克服這一問題，在某些較新的方案中采用了在合成的DNA模板中引入額外的酶切鑒定位點，這在提供一個較好的鑒定方案的同時，卻使得合成的DNA模板的堿基數超過了60個，從而導致DNA引物合成的成本及突變率有了較大程度的上漲。

發明內容

本發明的目的：構建一種高效穩定的編碼小片段RNA的載體并提供其配套制備方案，以克服當前科研領域及市場中常規制備編碼小片段RNA載體所面臨的啟動子3’端突變，構建過程中鑒定困難，合成模板DNA引物長，成本高等問題，同時以一種優化的結構使得轉錄小片段RNA的啟動子有更高的轉錄效率。

發明技術方案：(1)以晶賽公司的編碼多條shRNA質粒載體pEGFP6-1為骨架進行啟動子序列，生物元件布局及篩選基因插入等一系列改造從而構建出優化的編碼小片段RNA載體pGenesil-1.2。(2)化學合成編碼各小片段RNA所需的DNA模板并構建入pGenesil-1.2中，然后利用此系統中的雙重篩選方案篩選克隆并經測序鑒定完成構建工作。(3)將構建成功的編碼小片段RNA表達載體經多方面的有益性評價及實際應用效果測定。

有益效果：(1)本實用新型中利用BbsI，Esp3I，BsaI等限制性內切酶的消化位點在識別位點旁邊且消化位點序列沒有特異性的特性，在目的啟動子的3’端用這些內切酶來引入插入編碼小片段RNA的DNA模板所需的粘性末端，且末端堿基完全依照天然的啟動子3’端序列，從而確保啟動子3’端沒有任何突變，這為啟動子轉錄起始的穩定性和效率提供了保證；(2)本實用新型中利用BbsI，Esp3I，BsaI等限制性內切酶消化位點序列沒有特異性的特點，在插入位點兩側設計為用同一種內切酶但消化出的粘性末端不同，從而在制備過程中只需用一種內切酶消化即可，從而減化載體消化步驟；(3)本實用新型的載體中在模板DNA插入位點中預先引入標簽蛋白表達框，從而在很大程度上排除自身環化的非重組克隆，有效減少后期鑒定工作量；(4)本實用新型的載體中在DNA模板3’端的插入位點引入一種特殊設計，使得只有在化學合成的DNA模板成功插入載體形成正確的重組克隆后才會形成一個在原始模板對應位置所沒有的位點，從而在未增加合成DNA模板堿基數的情況下提供了有效的酶切鑒定方案；(5)本實用新型的載體中對各功能元件進行了優化排布，從而在未增加任何功能元件的前提下，使CMV的增強子能為小片段RNA的啟動子所用，提高其轉錄效率。

附圖說明