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[發明專利]豬繁殖與呼吸綜合征-安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗有效

專利信息
申請號: 200610166610.4 申請日: 2006-12-31
公開(公告)號: CN101209351A 公開(公告)日: 2008-07-02
發明(設計)人: 王忠德;封江南;孫永林;胡勤勤;吳娟;王遷遷;魏佳;李超;嚴俊 申請(專利權)人: 國營武昌造船廠
主分類號: A61K48/00 分類號: A61K48/00;A61K39/285;A61P31/20
代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司 代理人: 夏惠忠;樊戎
地址: 430060*** 國省代碼: 湖北;42
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 繁殖 呼吸 綜合征 安卡拉 牛痘 病毒 基因工程 疫苗
【說明書】:

技術領域

發明屬于生物技術領域,具體地是涉及基因工程疫苗,特別涉及豬繁殖與呼吸綜合征疫苗。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus,PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合征的病原,主要表現為妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸癥狀和高死亡率。PRRS自1987年首次報道發現于美國以來,現已遍及世界各主要養豬國家及地區,并已成為危害養豬業最嚴重的傳染病之一。PRRS的預防與防治主要依靠疫苗的接種。目前用于PRRS預防與防治的商用疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗。但已證實弱毒疫苗存在散毒及高幾率毒力返強的安全隱患,國外許多國家已禁用弱毒疫苗。滅活疫苗雖然安全性好,但不僅需要多次重復接種,而且免疫效果不理想,還經常可以導致免疫失敗。因此,迫切需要研制出更安全、高效、廉價的新型疫苗來預防與防治PRRS。

PRRSV是有囊膜的單股線性正鏈RNA病毒,其基因組全長約15kb,包括9個開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7)(Deas?et?al,J?Clin?Microbiol,1996;Snijderet?al,J?Gen?Virol,,1998)其中有ORF5編碼的GP5蛋白具有最強的中和病毒能力(Pirzadeh?et?al,J?Gen?Virol,1997,1998;Zhang?et?al,Vet?Microbiol,1998;Weiland?et?al,Vet?Microbiol,1999),GP5是目前構建PRRS重組病毒弱毒活疫苗和DNA疫苗的最佳候選基因。

Ostrowsi等(J?Virol,2002)在GP5暴露在囊膜表面的N-端鑒定了2個抗原表位,即表位A和表位B。表位A為A27V28L29N30,在誘導GP5的抗體上,A表位占主導地位,它通過抑制與其相隔僅7個氨基酸的中和性表位B被動免疫系統的識別,使免疫系統只產生針對表位A的非中和抗體,導致免疫后3周內豬血清內針對GP5的抗體是抗A表位的非中和抗體;而B表位由第37-45位連續的9個氨基酸殘基組成(抗體主要識別H38I43Y44N45),它所誘導的中和抗體出現較晚,感染后(4-6周)才能檢測到針對B位點的中和抗體,由此可見,A表位與PRRSV中和無關,在豬被PRRSV感染期間,抗GP5的抗體主要是針對A表位的非中和抗體,并將抗表位B的中和抗體的產生推遲至少3周,構建新一代PRRSV疫苗,表位A的存在是有害無益的,因此去除A表位抑制中和抗體的作用同時增強B表位產生中和抗體能力的工作是非常有必要的。

經改造的安卡拉牛痘病毒(Modified?VV?Ankara,MVA)是將牛痘病毒Ankara株經雞胚成纖維細胞傳570代后得到的。MVA屬于生物安全I級,作為疫苗載體有以下幾點優點:(1)可以攜帶較大的外源基因;(2)在人類和哺乳動物細胞中可以高表達重組蛋白;(3)引起較強的體液免疫和細胞免疫;(4)冷凍及凍干保存具有較長的穩定性。鑒于MVA的以上優點,將其作為疫苗載體攜帶PRRSV的GP5-BB,制成基因工程疫苗。

發明內容

本發明的任務是:采用安卡拉牛痘病毒作為載體,分別與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、GP5-DB基因重組得到DNA疫苗,目的是能達到理想的免疫效果,制備新型的基因工程疫苗。

實現本發明的技術方案是:

(1)從天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒中PCR擴增GP5基因,此處的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒來源于Liboratorios?Hipra公司生產的PRRS弱毒疫苗。

(2)將天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因采用豬偏愛密碼子將其核苷酸序列優化,并采用基因合成儀合成優化的序列GP5A,本處所述的優化是指用豬偏愛密碼子替換豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因原有的密碼子。

(3)利用PCR將優化GP5基因中的表位A替換為豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的表位B,新合成的基因稱為GP5-DB基因。

(4)將GP5和GP5-DB基因克隆到真核表達載體JN-2中,本處的真核表達載體JN-2由本實驗室構建(見圖十八)。

(5)將構建的JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB質粒與安卡拉牛痘病毒重組。

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