[發(fā)明專利]豬繁殖與呼吸綜合征－安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610166610.4
• 申請日: 2006-12-31
• 公開（公告）號: CN101209351A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發(fā)明（設計）人: 王忠德;封江南;孫永林;胡勤勤;吳娟;王遷遷;魏佳;李超;嚴俊
• 申請（專利權）人: 國營武昌造船廠
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/285;A61P31/20
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 夏惠忠;樊戎

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地是涉及基因工程疫苗，特別涉及豬繁殖與呼吸綜合征疫苗。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus，PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合征的病原，主要表現為妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸癥狀和高死亡率。PRRS自1987年首次報道發(fā)現于美國以來，現已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家及地區(qū)，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一。PRRS的預防與防治主要依靠疫苗的接種。目前用于PRRS預防與防治的商用疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗。但已證實弱毒疫苗存在散毒及高幾率毒力返強的安全隱患，國外許多國家已禁用弱毒疫苗。滅活疫苗雖然安全性好，但不僅需要多次重復接種，而且免疫效果不理想，還經常可以導致免疫失敗。因此，迫切需要研制出更安全、高效、廉價的新型疫苗來預防與防治PRRS。

PRRSV是有囊膜的單股線性正鏈RNA病毒，其基因組全長約15kb，包括9個開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7)(Deas?et?al，J?Clin?Microbiol，1996；Snijderet?al，J?Gen?Virol，，1998)其中有ORF5編碼的GP5蛋白具有最強的中和病毒能力(Pirzadeh?et?al，J?Gen?Virol，1997，1998；Zhang?et?al，Vet?Microbiol，1998；Weiland?et?al，Vet?Microbiol，1999)，GP5是目前構建PRRS重組病毒弱毒活疫苗和DNA疫苗的最佳候選基因。

Ostrowsi等(J?Virol，2002)在GP5暴露在囊膜表面的N-端鑒定了2個抗原表位，即表位A和表位B。表位A為A²⁷V²⁸L²⁹N³⁰，在誘導GP5的抗體上，A表位占主導地位，它通過抑制與其相隔僅7個氨基酸的中和性表位B被動免疫系統(tǒng)的識別，使免疫系統(tǒng)只產生針對表位A的非中和抗體，導致免疫后3周內豬血清內針對GP5的抗體是抗A表位的非中和抗體；而B表位由第37-45位連續(xù)的9個氨基酸殘基組成(抗體主要識別H³⁸I⁴³Y⁴⁴N⁴⁵)，它所誘導的中和抗體出現較晚，感染后(4-6周)才能檢測到針對B位點的中和抗體，由此可見，A表位與PRRSV中和無關，在豬被PRRSV感染期間，抗GP5的抗體主要是針對A表位的非中和抗體，并將抗表位B的中和抗體的產生推遲至少3周，構建新一代PRRSV疫苗，表位A的存在是有害無益的，因此去除A表位抑制中和抗體的作用同時增強B表位產生中和抗體能力的工作是非常有必要的。

經改造的安卡拉牛痘病毒(Modified?VV?Ankara，MVA)是將牛痘病毒Ankara株經雞胚成纖維細胞傳570代后得到的。MVA屬于生物安全I級，作為疫苗載體有以下幾點優(yōu)點：(1)可以攜帶較大的外源基因；(2)在人類和哺乳動物細胞中可以高表達重組蛋白；(3)引起較強的體液免疫和細胞免疫；(4)冷凍及凍干保存具有較長的穩(wěn)定性。鑒于MVA的以上優(yōu)點，將其作為疫苗載體攜帶PRRSV的GP5-BB，制成基因工程疫苗。

發(fā)明內容

本發(fā)明的任務是：采用安卡拉牛痘病毒作為載體，分別與豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、GP5-DB基因重組得到DNA疫苗，目的是能達到理想的免疫效果，制備新型的基因工程疫苗。

實現本發(fā)明的技術方案是：

(1)從天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒中PCR擴增GP5基因，此處的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒來源于Liboratorios?Hipra公司生產的PRRS弱毒疫苗。

(2)將天然豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因采用豬偏愛密碼子將其核苷酸序列優(yōu)化，并采用基因合成儀合成優(yōu)化的序列GP5A，本處所述的優(yōu)化是指用豬偏愛密碼子替換豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因原有的密碼子。

(3)利用PCR將優(yōu)化GP5基因中的表位A替換為豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的表位B，新合成的基因稱為GP5-DB基因。

(4)將GP5和GP5-DB基因克隆到真核表達載體JN-2中，本處的真核表達載體JN-2由本實驗室構建(見圖十八)。

(5)將構建的JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB質粒與安卡拉牛痘病毒重組。