[發明專利]一種纖溶酶及其培制方法

有效

• 申請號: 200610163479.6
• 申請日: 2006-12-04
• 公開（公告）號: CN101134951A
• 公開（公告）日: 2008-03-05
• 發明（設計）人: 劉曉蘭;鄭喜群;鄧永平;吳耘紅
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12N1/14
• 代理公司: 齊齊哈爾鶴城專利事務所
• 代理人: 葉仲剛

技術領域

本發明涉及一種纖溶酶，本發明還涉及一種該纖溶酶的培制方法。

背景技術

血栓類疾病嚴重的威脅著人類的生命和健康，是導致當今人類死亡的最主要原因之一，而且在目前這種病的發病率仍然在逐年上升。眼下血栓疾病的治療方法主要有三種：一是外科手術法，從操作上看，這種方法對技術的條件要求很高，操作上難度也很大，患者需要付出的費用也很昂貴。二是抗栓療法，即給患者長期服用阿斯匹林等抗凝藥物，雖然在很大程度上可以控制病情，但是卻不能除去已經形成的血栓。三是溶栓療法，即給患者注射溶栓劑以促使血管再通，這種方法與前兩種方法比具有高效、特異、費用低等特點，因此溶栓藥物的研究開發在國際、國內都相當活躍。從六十年代溶栓藥物上市到現在，溶栓劑的發展大致分三代：第一代溶栓劑：包括鏈激酶(streptokinase，SK)、尿激酶(urokinase，UK)等，所存在的不足是這類制劑具有其自身難以克服的缺陷，如引起出血等副作用等。第二代溶栓劑：包括t-PA、pro-UK、APSAC，這些制劑雖然較上一代產品已有所改進，但是這種缺陷依然存在。第三代溶栓劑是正在研究開發中的溶栓藥物。目前國際上正在致力于以下兩種研究：一是用蛋白質工程，如分子定點突變，結構域的刪除、增加、拼接或融合等手段對現有溶栓劑分子進行改造。二是積極開發各種生物來源的血栓溶解物質。現已有從蛇毒、蚯蚓、微生物以及吸血昆蟲和海洋生物中提取到了具有纖溶活性的物質的報道。在自然界，由于微生物的種類繁多，來源廣泛，再加上其自身所具有的繁殖快，生長周期短，適應性強的優勢，各國的發酵工業又都有較為完備甚至是十分發達的基礎，一旦有了成熟的工藝，很快就可以大批量地生產，因此，應用微生物生產溶栓劑展示出了特別誘人的前景。

目前，國內有關纖溶酶的研究可以說是才剛剛開始，已有的少量成果主要還局限于蚯蚓纖溶酶，此外，僅有幾項從鏈霉菌Y405、鏈霉菌C3662發酵液中提取到的纖溶酶等報導。在臨床應用研究中，需要具有大量的備選品種和相關產物以便于加以比較和從中篩選，而目前我們現已取得的進展還遠遠不能滿足臨床上的研究需要。

發明內容

本發明的發明目的在于提供一種纖溶酶，該纖溶酶不僅具有很好的溶栓性能，而且使用上安全性好，制備成本也很低廉。本發明的另一個發明目的還在于提供一種該纖溶酶的培制方法。

本發明產品纖溶酶培養所使用的菌種為Neurospora?sitophlia?17號好食脈孢霉，保藏號為CGMCC?No.1836。該菌株是本申請人于1999年3月在中國北方醬類食品發酵中間產物醬塊中分離、篩選得到的。

以上述菌株為菌種，經過培養發酵、分離和提純，便可培制出本發明的纖溶酶產品。

本發明的培制的纖溶酶經SDS-PAGE法和凝膠過濾層析法的分析測定，被證實為具有以下酶學性質：該纖溶酶酶分子由兩個亞基組成，相對分子量分別為30000和15500，IEF測定等電點為7.9±0.2。

該纖溶酶酶分子有直接溶解纖維蛋白和激活纖溶酶原間接溶解纖維蛋白的作用，可以順次降解纖維蛋白原α、β和γ鏈。還可以水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，測得的酶促反應的米氏常數為0.24mmol/L；該纖溶酶不降解人血清蛋白，最適作用pH為7.4，適宜在人體生理pH下發揮作用，在pH4.8-9.8范圍內37℃保溫24h后酶活力保持在80％以上；最適作用溫度為50℃，在32℃-42℃保溫4h酶活力保持在75％以上；Fe²⁺和Fe³⁺在離子濃度為0.5mmol/L時對酶的活性有激活作用，該纖溶活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制。

本發明產品的培制方法：以Neurospora?sitophlia?17號好食脈孢霉為菌種，經固體發酵法培養后產生纖溶酶，將固體發酵物用生理鹽水浸提6h，用紗布過濾除去菌體和固形物，收集濾過液，用40％～80％飽和度的硫酸銨分級鹽析，再采用現代色譜分離技術對該纖溶酶進行純化，使酶純度達到色譜純。

本發明產品的制備具體步驟：

1、以Neurospora?sitophlia?17號好食脈孢霉為菌種，經過斜面培養、固體發酵培養生產纖溶酶；

2、培養方法：斜面培養—→固體發酵培養