[發明專利]馬鈴薯病毒和類病毒檢測試劑盒及應用

無效

• 申請號: 200610156123.X
• 申請日: 2006-12-27
• 公開（公告）號: CN101210271A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 吳志明;謝曉亮;溫春秀;周巧梅;田偉;劉銘;馬占元;董文琦;高秀瑞
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 葉凡

技術領域

本發明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種馬鈴薯病毒和類病毒的復合RT-PCR檢測試劑盒，本發明還涉及該試劑盒的制備方法及應用技術操作規程，屬于植物病毒檢驗、檢疫領域。

背景技術

馬鈴薯(Solanum?tuberosum?L.)是我國應用價值較高的經濟作物，種植面積居世界第一位，面積已達6600萬畝，總產量5609.6萬噸。馬鈴薯適宜栽培區域廣泛，但病毒病害嚴重影響了馬鈴薯的產量和品質，在我國引起馬鈴薯退化的主要病毒有馬鈴薯卷葉病毒(Potato?leafroll?virus，PLRV)、馬鈴薯X病毒(Potato?virusX，PVX)、馬鈴薯Y病毒(Potato?virus?Y，PVY)、馬鈴薯S病毒(Potato?virus?S，PVS)、馬鈴薯A病毒(Potato?virus?A，PVA)和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato?spindle?tuberviroid，PSTVd)，且多數是復合感染。

馬鈴薯已被列為我國7大作物之一，也是中國西部最重要的作物品種和主要的支柱型產業，發展勢頭良好，但目前我國馬鈴薯單產只有發達國家平均單產的1/3，馬鈴薯病毒是造成馬鈴薯產量低、質量差的主要原因。目前生產上普遍采用馬鈴薯脫毒種薯來防治病毒病的危害，為確保馬鈴薯原原種、原種的脫毒質量，建立快速、準確、靈敏、高效的馬鈴薯病毒類病毒檢測技術是馬鈴薯種薯生產的關鍵技術環節，也是馬鈴薯產業良性發展的迫切需要。

國內馬鈴薯病毒檢測主要是山東農科院和國際馬鈴薯研究中心提供的ELISA檢測試劑盒，這種酶聯免疫檢測技術依賴于抗血清，血清大多依賴進口，價格高，不適合生產的需要，且免疫學檢測技術的靈敏度低和準確性差，在生產上應用具有較大的局限性，極大地限制了我國馬鈴薯種薯生產病毒檢測的普及和應用；同時ELISA不能準確的檢測到休眠塊莖中的PLRV和PVY病毒，在檢測前需打破休眠；此外，對于不具有免疫原性的PSTVd類病毒來說，根本無法使用ELISA技術進行檢測。因此生產上迫切需要一種全面、快速、簡便、靈敏、廉價的檢測技術。

聚合酶聯式反應(Polymerase?chain?reaction，PCR)與ELISA檢測相比具有靈敏度高、特異性強和準確可靠及穩定性好的特點，被認為是病毒檢測技術的一次革命，已在許多植物病毒上應用。常見的馬鈴薯病毒大多是單鏈RNA病毒，需要先將病毒RNA反轉錄后再進行PCR擴增，即反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse-transcriptionPolymerase?Chain?Reaction，RT-PCR)技術。隨著分子生物學技術的不斷發展，近年來已由一次只能檢測一種病毒的單一RT-PCR技術發展到可以同步檢測兩種至多種病毒的雙重PCR(d-RT-PCR)、復合RT-PCR(m-RT-PCR)檢測。復合RT-PCR檢測技術可以同時檢測多種病毒和類病毒，在大大提高檢測的準確性和靈敏度的同時，還大大降低了檢測的成本、縮短了檢測時間，成為馬鈴薯病毒類病毒RT-PCR檢測的方向和主流。加拿大科學家Nie等曾經探討用隨機引物進行馬鈴薯主要病毒和類病毒的復合RT-PCR檢測研究，國內王中康等也開展了有關研究。但是他們都沒有對病毒檢測過程中存在的假陰性結果的問題提出有效解決的辦法，沒能構建一種試劑盒來同時檢測馬鈴薯的5種病毒和1種類病毒。研究馬鈴薯的5種病毒和1種類病毒同步快速RT-PCR檢測，解決RT-PCR檢測過程中易出現假陰性結果的問題，解決同時檢測馬鈴薯病毒和類病毒的問題，解決脫毒馬鈴薯產業發展的限制性問題都具有重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有檢測方法不能同時檢測馬鈴薯病毒和類病毒，檢測成本高，時間長的問題；克服RT-PCR檢測中的假陰性問題，提供一種新的馬鈴薯病毒和類病毒的復合RT-PCR檢測試劑盒，來同時檢測馬鈴薯病毒和類病毒，且快速、簡便、靈敏、廉價。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種馬鈴薯病毒和類病毒的復合RT-PCR檢測試劑盒，由組分I和組分II組成，組分I由將馬鈴薯病毒和類病毒mRNA逆轉錄為cDNA第1鏈的必要試劑所組成，包括：逆轉錄酶、RNA酶抑制劑，dNTP混合物，檢測對象的cDNA第1鏈的互補引物，cDNA第1鏈反應緩沖液；組分II由以cDNA第1鏈為摸板進行PCR擴增的必要試劑所組成，包括：PCR反應緩沖液，dNTP混合物，MgCl₂，Taq?DNA聚合酶，復合PCR引物組合等；